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13808906306

金虫 (正式写手)

[求助] PCR引物的量如何确定，求助高手指教已有1人参与

最近做PCR发现一个问题，一些资料上说PCR体系中引物的量要稍大于模板的量，可是在PCR过程中引物不断被消耗，我计算了下十几二十几个循环后引物明显不够啊，比如我做的PCR  50ul 体系：引物1、2各为25 pmol ，模板量4 pmol ，我的是倍数扩增，按我的做法不到四个循，引物环就消耗干净了。可是我在实际操作中发现，PCR在第二十五、六个循环才出条带，这是为什么啊。求高人指点
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1楼2012-02-23 15:37:38
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13808906306

金虫 (正式写手)
坐等高人指点
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2楼2012-02-23 15:40:46
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板量4 pmol 这个说法你是不是误解了？
假设模板为400bp的DNA片段1ng/ul，使用1ul作模板。在100ul体系中，
则模板量为0.01ng/ul换算出来即为0.037nM(而1nM=0.001pmol/ul，0.037nM=0.000037pmol/ul)
而引物为10pmol/ul使用1ul加到100的体系里也有0.1pmol/ul>>0.000037pmol/ul
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伟大航线....
3楼2012-02-23 16:36:33
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13808906306

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by longrna at 2012-02-23 16:36:33:
模板量4 pmol 这个说法你是不是误解了？
假设模板为400bp的DNA片段1ng/ul，使用1ul作模板。在100ul体系中，
则模板量为0.01ng/ul换算出来即为0.037nM(而1nM=0.001pmol/ul，0.037nM=0.000037pmol/ul)
而引物为1 ...

木有误解啊，我是用紫外分光光度计测的浓度：14ug/ml ，片段长度为77bp（算出来大概就是0.56pmol/ul），然后取7ul做模板，差不多就是4pmol啊，然后引物是10uM的，也就是10pmol/ul，取2.5ul加入到50ul体系，也就是25pmol了
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4楼2012-02-23 16:50:44
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你算法有误吧
7ul模板（模板太多了）=7ul*14ng/ul=98ng 加入50ul体系 98ng/50ul=1.96ng/ul(算2ng/ul)
2ng/ul的 77bp DNA你怎么算成4pmol? 应该是40nM(即0.04pmol/ul，而不是4pmol)
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伟大航线....
5楼2012-02-23 16:59:49
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13808906306

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2012-02-23 16:59:49:
你算法有误吧
7ul模板（模板太多了）=7ul*14ng/ul=98ng 加入50ul体系 98ng/50ul=1.96ng/ul(算2ng/ul)
2ng/ul的 77bp DNA你怎么算成4pmol? 应该是40nM(即0.04pmol/ul，而不是4pmol)

哥，你误解我了，我的DNA样品是14ng/ul，我加了7ul，你算算这7ul是不是3.92pmol，
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6楼2012-02-23 17:31:47
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longrna

新虫 (正式写手)
肯定不是啦，你怎么算的？
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伟大航线....
7楼2012-02-23 17:40:36
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海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3): 呵呵 2012-02-24 10:51:54
这个问题与算法无关。
楼主，你的算法可能没错，但是，你忽略一个重要问题：你的DNA都是你的目的产物吗？肯定有许多其他无关序列的。
因此，计算没有丝毫意义。这也是平常做PCR的时候根本不会计算的原因。

即使能够定量。随着循环数的提高，引物的使用量非常惊人的。另外，只要确实有目的序列，那么使用标准算法没什么问题的。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
8楼2012-02-24 08:26:25
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wangwei2008

木虫 (职业作家)

小木虫之移花宫主
引用回帖:
8楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-02-24 08:26:25:
这个问题与算法无关。
楼主，你的算法可能没错，但是，你忽略一个重要问题：你的DNA都是你的目的产物吗？肯定有许多其他无关序列的。
因此，计算没有丝毫意义。这也是平常做PCR的时候根本不会计算的原因。

即 ...

这个兄弟貌似说的有道理
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9楼2012-02-24 10:32:42
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13808906306

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-02-24 08:26:25:
这个问题与算法无关。
楼主，你的算法可能没错，但是，你忽略一个重要问题：你的DNA都是你的目的产物吗？肯定有许多其他无关序列的。
因此，计算没有丝毫意义。这也是平常做PCR的时候根本不会计算的原因。

即 ...

这位说的有道理，但是我把PCR产物跑非变性PAGE凝胶发现确实是只有一条带，就算有杂的DNA相信亮也是很少的，所以我还是纠结我的问题，能给解答我的原始问题吗？
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10楼2012-02-24 15:34:52
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