应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR引物的量如何确定，求助高手指教
北京石油化工学院2025年硕士研究生招生接受调剂公告
121/2返回列表12下一页
查看: 3677  |  回复: 11
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者13808906306将赠送您 10 个金币

13808906306

金虫 (正式写手)

[求助] PCR引物的量如何确定，求助高手指教已有1人参与

最近做PCR发现一个问题，一些资料上说PCR体系中引物的量要稍大于模板的量，可是在PCR过程中引物不断被消耗，我计算了下十几二十几个循环后引物明显不够啊，比如我做的PCR  50ul 体系：引物1、2各为25 pmol ，模板量4 pmol ，我的是倍数扩增，按我的做法不到四个循，引物环就消耗干净了。可是我在实际操作中发现，PCR在第二十五、六个循环才出条带，这是为什么啊。求高人指点
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2012-02-23 15:37:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

13808906306

金虫 (正式写手)
坐等高人指点
回复此楼
2楼2012-02-23 15:40:46
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板量4 pmol 这个说法你是不是误解了？
假设模板为400bp的DNA片段1ng/ul，使用1ul作模板。在100ul体系中，
则模板量为0.01ng/ul换算出来即为0.037nM(而1nM=0.001pmol/ul，0.037nM=0.000037pmol/ul)
而引物为10pmol/ul使用1ul加到100的体系里也有0.1pmol/ul>>0.000037pmol/ul
赞一下 回复此楼
伟大航线....
3楼2012-02-23 16:36:33
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

13808906306

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by longrna at 2012-02-23 16:36:33:
模板量4 pmol 这个说法你是不是误解了？
假设模板为400bp的DNA片段1ng/ul，使用1ul作模板。在100ul体系中，
则模板量为0.01ng/ul换算出来即为0.037nM(而1nM=0.001pmol/ul，0.037nM=0.000037pmol/ul)
而引物为1 ...

木有误解啊，我是用紫外分光光度计测的浓度：14ug/ml ，片段长度为77bp（算出来大概就是0.56pmol/ul），然后取7ul做模板，差不多就是4pmol啊，然后引物是10uM的，也就是10pmol/ul，取2.5ul加入到50ul体系，也就是25pmol了
赞一下 回复此楼
4楼2012-02-23 16:50:44
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你算法有误吧
7ul模板（模板太多了）=7ul*14ng/ul=98ng 加入50ul体系 98ng/50ul=1.96ng/ul(算2ng/ul)
2ng/ul的 77bp DNA你怎么算成4pmol? 应该是40nM(即0.04pmol/ul，而不是4pmol)
赞一下 回复此楼
伟大航线....
5楼2012-02-23 16:59:49
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

13808906306

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2012-02-23 16:59:49:
你算法有误吧
7ul模板（模板太多了）=7ul*14ng/ul=98ng 加入50ul体系 98ng/50ul=1.96ng/ul(算2ng/ul)
2ng/ul的 77bp DNA你怎么算成4pmol? 应该是40nM(即0.04pmol/ul，而不是4pmol)

哥，你误解我了，我的DNA样品是14ng/ul，我加了7ul，你算算这7ul是不是3.92pmol，
赞一下 回复此楼
6楼2012-02-23 17:31:47
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)
肯定不是啦，你怎么算的？
赞一下 回复此楼
伟大航线....
7楼2012-02-23 17:40:36
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3): 呵呵 2012-02-24 10:51:54
这个问题与算法无关。
楼主，你的算法可能没错，但是，你忽略一个重要问题：你的DNA都是你的目的产物吗？肯定有许多其他无关序列的。
因此，计算没有丝毫意义。这也是平常做PCR的时候根本不会计算的原因。

即使能够定量。随着循环数的提高，引物的使用量非常惊人的。另外，只要确实有目的序列，那么使用标准算法没什么问题的。
赞一下 回复此楼
天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
8楼2012-02-24 08:26:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangwei2008

木虫 (职业作家)

小木虫之移花宫主
引用回帖:
8楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-02-24 08:26:25:
这个问题与算法无关。
楼主，你的算法可能没错，但是，你忽略一个重要问题：你的DNA都是你的目的产物吗？肯定有许多其他无关序列的。
因此，计算没有丝毫意义。这也是平常做PCR的时候根本不会计算的原因。

即 ...

这个兄弟貌似说的有道理
赞一下 回复此楼
9楼2012-02-24 10:32:42
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

13808906306

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-02-24 08:26:25:
这个问题与算法无关。
楼主，你的算法可能没错，但是，你忽略一个重要问题：你的DNA都是你的目的产物吗？肯定有许多其他无关序列的。
因此，计算没有丝毫意义。这也是平常做PCR的时候根本不会计算的原因。

即 ...

这位说的有道理，但是我把PCR产物跑非变性PAGE凝胶发现确实是只有一条带，就算有杂的DNA相信亮也是很少的，所以我还是纠结我的问题，能给解答我的原始问题吗？
赞一下 回复此楼
10楼2012-02-24 15:34:52
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转

分子生物

     我要订阅楼主 13808906306 的主题更新
    121/2返回列表12下一页
    不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
    普通表情 龙 兔 虎 猫
    最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
    [药学] 药典2025电子版齐活了 +6 sdcumt 2025-04-21 9/450 2025-04-23 07:04 by huahua1216
    [论文投稿] 论文返修后直接变成awaiting AE recommendation？ 20+4 小木脑虫 2025-04-19 12/600 2025-04-23 01:30 by 小木脑虫
    [考研] 299求调剂 +3 小村庄328 2025-04-21 5/250 2025-04-22 17:10 by 给个书
    [考研] 326求调剂 +8 笑三生丶 2025-04-19 9/450 2025-04-22 15:42 by wzn1234
    [论文投稿] 论文什么时候能够接收阿？我想顺利毕业 5+4 求顺利拜托了 2025-04-20 11/550 2025-04-22 11:34 by 我是宇宙中的一�
    [论文投稿] Nature communications和IEEE PAMI，投哪个期刊好？ +7 hdxnhjtx 2025-04-16 7/350 2025-04-21 22:31 by shadowout
    [考研] 318分求调剂，有学上就去！ +3 pol-395 2025-04-21 5/250 2025-04-21 17:02 by pol-395
    [考研] 复试调剂 +5 liquorhui 2025-04-17 7/350 2025-04-21 14:24 by 求学者9
    [基金申请] 有人N个“优秀”结题却无一出版过 +7 xinrenxf 2025-04-20 12/600 2025-04-21 12:21 by xinrenxf
    [考研] 调剂！ +4 半岛铁盒、 2025-04-17 15/750 2025-04-20 19:39 by heping4755
    [考研] 267求调剂 +4 爱喝饮料的大人� 2025-04-16 5/250 2025-04-20 17:49 by 求学者9
    [考研] 346求调剂 +7 135692fasfas 2025-04-19 8/400 2025-04-19 21:18 by asdhh1991
    [论文投稿] 有没有推荐的sci三区 计算机 20+3 。。。.。. 2025-04-16 9/450 2025-04-19 20:22 by liunahan
    [论文投稿] 论文online阶段想要修改内容，编辑让我发给他the journal reference number +4 木棉618 2025-04-16 8/400 2025-04-19 19:22 by 木棉618
    [考研] 085801电气工程总分283求调剂 +3 腊肉蛋炒饭 2025-04-18 3/150 2025-04-18 18:22 by 我是01
    [考研] 材料调剂求助 +4 国际公法 2025-04-18 9/450 2025-04-18 17:19 by dengwei2012
    [教师之家] 高校不得干扰单身教师的个人情感隐私，如果教师情感并没有影响教学 +4 瞬息宇宙 2025-04-16 4/200 2025-04-18 11:38 by zeolitess
    [考研] 299求调剂 +3 花大杀手呀 2025-04-17 3/150 2025-04-18 10:27 by 甜不辣123
    [考研] 326求调剂 +3 小余不会发球 2025-04-16 6/300 2025-04-18 10:12 by hhy12096032
    [考研] 22自命题327分 +9 叫我大明 2025-04-16 10/500 2025-04-18 00:46 by L1q1ng2h3ng
    信息提示
    关闭
    请填处理意见
    关闭
    复试调剂复试调剂
    复试调剂二维码获取复试 & 调剂指南！微信扫一扫
    商务合作商务合作
    商务合作二维码商务合作咨询微信扫一扫(备注：商务合作)
    学术干货学术干货
    学术干货二维码微信扫一扫了解最新学术干货
    论文辅导论文辅导
    论文辅导二维码微信扫一扫添加老师，免费咨询
    师资招募师资招募