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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR引物一大堆CG，跪求大神们支招
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a小孩子

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR引物一大堆CG，跪求大神们支招 已有1人参与

我用PET-28a载体，设计的引物序列是TTAGGATCC---ATGTGCGAGCCCGGGGACATTAC，这是mRNA,在各种数据里都找不到ATG前面的序列，用这个作为上游引物能不能P出来呀？还有其他的什么办法能把这发夹解开吗？跪求…………急…………谢谢各位大侠！
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1楼 2014-03-20 12:49:21
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tu475575025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
a小孩子(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-20 17:01:51
AGCCCGGGGA包含SmaI位点，我最近的引物也总是出现这个问题，你可以在5‘上用AT来平衡，5‘的发夹也没有什么关系，只要3’有十几bp互补都是可以p出来的，但一定确保3’与模板互补的十几bp没有发夹! 另外在5‘加碱基时要考虑错配，尽量避免错配，同时平衡Tm值。没有ATG前面的序列也没有关系，你只要ATG下游的序列吧。
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2楼2014-03-20 15:31:26
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a小孩子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tu475575025 at 2014-03-20 15:31:26
AGCCCGGGGA包含SmaI位点，我最近的引物也总是出现这个问题，你可以在5‘上用AT来平衡，5‘的发夹也没有什么关系，只要3’有十几bp互补都是可以p出来的，但一定确保3’与模板互补的十几bp没有发夹! 另外在5‘加碱基时 ...

谢谢！前面三个保护碱基我已经用AT来平衡了。主要是ATG后的四个碱基ATGT与后面的几个碱基TACA形成发卡，那么多GC连在一起，我也担心错配这种情况。用的模版是cDNA,平时没什么问题的引物都有点难出带，不知道是不是cDNA质量的原因。
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3楼2014-03-21 16:37:09
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tu475575025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-22 22:40:39
给你出个主意：
1、设计一对有突变的引物，5端带上你要的GC，发夹结构处适当突变一两个碱基，3端再多加几个互补碱基，这个就避免了发夹结构，应该是可以p出来，但是p出来的基因读码可能应为一两个碱基的突变而出错（如果你考虑一下密码子，看有没可能设计无义突变来避免发夹）；
2、然后就是用你现在的引物以上一轮突变的产物做模板来扩增，特异性肯定很高（除了你突变的一两个碱基，都能完全互补）
ps：用简单的模板（质粒、纯化的pcr产物）可以减少错配，不用复杂的。
同是被实验虐，这是我的经验，祝成功！
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4楼2014-03-22 19:51:16
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