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a小孩子

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR引物一大堆CG,跪求大神们支招 已有1人参与

我用PET-28a载体,设计的引物序列是TTAGGATCC---ATGTGCGAGCCCGGGGACATTAC,这是mRNA,在各种数据里都找不到ATG前面的序列,用这个作为上游引物能不能P出来呀?还有其他的什么办法能把这发夹解开吗?跪求…………急…………谢谢各位大侠!
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tu475575025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
a小孩子(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-20 17:01:51
AGCCCGGGGA包含SmaI位点,我最近的引物也总是出现这个问题,你可以在5‘上用AT来平衡,5‘的发夹也没有什么关系,只要3’有十几bp互补都是可以p出来的,但一定确保3’与模板互补的十几bp没有发夹! 另外在5‘加碱基时要考虑错配,尽量避免错配,同时平衡Tm值。没有ATG前面的序列也没有关系,你只要ATG下游的序列吧。
2楼2014-03-20 15:31:26
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a小孩子

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by tu475575025 at 2014-03-20 15:31:26
AGCCCGGGGA包含SmaI位点,我最近的引物也总是出现这个问题,你可以在5‘上用AT来平衡,5‘的发夹也没有什么关系,只要3’有十几bp互补都是可以p出来的,但一定确保3’与模板互补的十几bp没有发夹! 另外在5‘加碱基时 ...

谢谢!前面三个保护碱基我已经用AT来平衡了。主要是ATG后的四个碱基ATGT与后面的几个碱基TACA形成发卡,那么多GC连在一起,我也担心错配这种情况。用的模版是cDNA,平时没什么问题的引物都有点难出带,不知道是不是cDNA质量的原因。
3楼2014-03-21 16:37:09
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tu475575025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-22 22:40:39
给你出个主意:
1、设计一对有突变的引物,5端带上你要的GC,发夹结构处适当突变一两个碱基,3端再多加几个互补碱基,这个就避免了发夹结构,应该是可以p出来,但是p出来的基因读码可能应为一两个碱基的突变而出错(如果你考虑一下密码子,看有没可能设计无义突变来避免发夹);
2、然后就是用你现在的引物以上一轮突变的产物做模板来扩增,特异性肯定很高(除了你突变的一两个碱基,都能完全互补)
ps:用简单的模板(质粒、纯化的pcr产物)可以减少错配,不用复杂的。
同是被实验虐,这是我的经验,祝成功!
4楼2014-03-22 19:51:16
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