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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR引物之NcoI的问题
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njutjhy

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR引物之NcoI的问题

想做个PCR，在设计引物时遇到点问题。故在此发帖求助列位虫友！
目的基因：5’-CAG ……-3'
目标载体：PET-28a
我想在目的基因上游加Nco I 酶切序列（C/ CATGG），也需要酶切序列中的ATG作为起始密码子。
但是后面多余了个G，会造成移码突变的。结合各种信息，用这个酶及其中ATG的处理方法
1.如果目的基因是以G开头的，那很好，直接使用。可惜我的不是！
2.可以在G之后根据引物的GC含量补充两个密码子。不知道这样会不会对酶的结构产生很大的影响？
3.把后面的目的基因第一个密码子改为G（譬如把CAG的改为GAG），但是这就是突变了，也应该会对酶产生影响的吧！
4.在CATGG后面随便加上两个密码子之后再加个ATG，再接上目的基因。不知道这样会对目的基因的表达产生什么影响？会不会导致表达量降低很多？
欢迎各位虫友表达针对以上各种方法阐述自己的意见，或者提出不同的建议！参与就有金币拿！
金币不多，先悬赏100个吧！

[ Last edited by yqbter on 2012-11-2 at 10:22 ]
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冷眼看世间冷暖，笑谈人生得失
1楼 2012-11-01 10:46:38
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回帖置顶 ( 共有1个 )

njutjhy

铜虫 (小有名气)
njutjhy: 回帖置顶 2012-11-02 17:08:54
没有更多人参与了呢？
只要参与就有金币拿啊！
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冷眼看世间冷暖，笑谈人生得失
5楼2012-11-02 09:21:20
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普通回帖

njutjhy

铜虫 (小有名气)
第一次发帖沉了！难道这次又沉了？？？
PS:话说笨虫发帖之前已经在站内搜索过了的，所以智能机器人推荐的没用啊！
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冷眼看世间冷暖，笑谈人生得失
2楼2012-11-01 14:15:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
njutjhy: 金币+10, ★★★很有帮助, 第一个回答的，果断奖励下！ 2012-11-01 14:49:55
njutjhy: 金币+2, ★★★很有帮助, 建议很好，稍微奖励下！ 2012-11-01 14:50:28
先确定一点的是不能有移码，否则产物完全不是目的蛋白了。能否加两个碱基来表达要看你的目的。一般来说，在蛋白的N端或者C端加几个氨基酸，对整个蛋白的结构和功能影响不大。但是你需要自己来验证。
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3楼2012-11-01 14:35:41
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
njutjhy: 金币+5, ★★★很有帮助, 多谢！ 2012-11-01 15:50:40
根据PET28的图谱，添加GC补齐，再跟你的基因就行了，多了一个氨基酸。影响不大。
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Thank-you，so-blue.
4楼2012-11-01 15:29:54
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竹子小小

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
njutjhy: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-02 16:53:36
多就多了吧，即使突变一个氨基酸一般也没事的，只要不移码就行。实在想要完全一样的那就换个酶啊，在ATG外面取引物位置就行了。载体一般不会多了几个碱基就用不了。
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6楼2012-11-02 10:50:38
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竹子小小

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
njutjhy: 金币+2, ★有帮助, 关键是在pet28上，rbs位点后面就是NCO1的酶切位点的 2012-11-02 16:54:58
哦，看错，你用另一个酶也许的，把ATG设计在引物里。
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7楼2012-11-02 10:52:10
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加内特

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
njutjhy: 金币+8, ★★★很有帮助 2012-11-02 16:55:28
在pet28用Nco I 酶切位点，你是要把组氨酸标签切掉吗？楼主注意，如果你后续纯化需要用到组氨酸标签，那你就换个酶切位点。在C端的组氨酸标签效果不是很好。一般蛋白质加一个两个氨基酸影响不是很大，在pet28上用BamH I和Hind I把酶加组氨酸标签，会额外多好几个氨基酸，影响都不是很大。防止Nco I 酶切位点的移码突变，楼主就用你的自己提出的第1、2条就行了。
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少壮不努力，老大徒伤悲！
8楼2012-11-02 11:16:12
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njutjhy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 加内特 at 2012-11-02 11:16:12
在pet28用Nco I 酶切位点，你是要把组氨酸标签切掉吗？楼主注意，如果你后续纯化需要用到组氨酸标签，那你就换个酶切位点。在C端的组氨酸标签效果不是很好。一般蛋白质加一个两个氨基酸影响不是很大，在pet28上用Ba ...

我是把原来导入pet28a的一段基因的信号肽给切了的。那段基因原始在Nco1和Hind3之间的。
准备同时做两个下游的引物，一个保留组氨酸标签，一个不要his-tag的。
你提到了“在C端的组氨酸标签效果不是很好”，这个一般比在N段的差很多么？还是分离比较困难？
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冷眼看世间冷暖，笑谈人生得失
9楼2012-11-02 17:05:42
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dy_414

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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njutjhy: 金币+6, ★★★很有帮助, 我决定还是采用定点突变——把后一个氨基酸给突变掉了。多谢回复！ 2012-11-03 14:45:54
可以加两个碱基，即最后翻译的蛋白N端多一个氨基酸，碱基选取可以参考蛋白等电点，对整体等电点影响不大即可，当然要避开Lys，Cys和Asp
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我坚信，rp是攒出来的
10楼2012-11-03 11:45:51
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