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a小孩子

新虫 (初入文坛)

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[求助] PCR引物一大堆CG，跪求大神们支招已有1人参与

我用PET-28a载体，设计的引物序列是TTAGGATCC---ATGTGCGAGCCCGGGGACATTAC，这是mRNA,在各种数据里都找不到ATG前面的序列，用这个作为上游引物能不能P出来呀？还有其他的什么办法能把这发夹解开吗？跪求…………急…………谢谢各位大侠！

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1楼2014-03-20 12:49:21

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a小孩子

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by tu475575025 at 2014-03-20 15:31:26
AGCCCGGGGA包含SmaI位点，我最近的引物也总是出现这个问题，你可以在5‘上用AT来平衡，5‘的发夹也没有什么关系，只要3’有十几bp互补都是可以p出来的，但一定确保3’与模板互补的十几bp没有发夹! 另外在5‘加碱基时 ...

谢谢！前面三个保护碱基我已经用AT来平衡了。主要是ATG后的四个碱基ATGT与后面的几个碱基TACA形成发卡，那么多GC连在一起，我也担心错配这种情况。用的模版是cDNA,平时没什么问题的引物都有点难出带，不知道是不是cDNA质量的原因。

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3楼2014-03-21 16:37:09

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