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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR引物的量如何确定，求助高手指教
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13808906306

金虫 (正式写手)

[求助] PCR引物的量如何确定，求助高手指教 已有1人参与

最近做PCR发现一个问题，一些资料上说PCR体系中引物的量要稍大于模板的量，可是在PCR过程中引物不断被消耗，我计算了下十几二十几个循环后引物明显不够啊，比如我做的PCR  50ul 体系：引物1、2各为25 pmol ，模板量4 pmol ，我的是倍数扩增，按我的做法不到四个循，引物环就消耗干净了。可是我在实际操作中发现，PCR在第二十五、六个循环才出条带，这是为什么啊。求高人指点
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1楼 2012-02-23 15:37:38
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板量4 pmol 这个说法你是不是误解了？
假设模板为400bp的DNA片段1ng/ul，使用1ul作模板。在100ul体系中，
则模板量为0.01ng/ul换算出来即为0.037nM(而1nM=0.001pmol/ul，0.037nM=0.000037pmol/ul)
而引物为10pmol/ul使用1ul加到100的体系里也有0.1pmol/ul>>0.000037pmol/ul
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伟大航线....
3楼2012-02-23 16:36:33
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你算法有误吧
7ul模板（模板太多了）=7ul*14ng/ul=98ng 加入50ul体系 98ng/50ul=1.96ng/ul(算2ng/ul)
2ng/ul的 77bp DNA你怎么算成4pmol? 应该是40nM(即0.04pmol/ul，而不是4pmol)
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伟大航线....
5楼2012-02-23 16:59:49
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longrna

新虫 (正式写手)
肯定不是啦，你怎么算的？
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伟大航线....
7楼2012-02-23 17:40:36
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