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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 设计引物装载体 求高手
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箫箫客

银虫 (小有名气)

[求助] 设计引物装载体 求高手

设计引物一定要保证是3的倍数吗？如果不是3的倍数会不会载入载体后会发生移码吗？一般把目的片段装入载体时会考虑载体上的移码而不会考虑获得的PCR序列，到底要不要考虑呀，突然想到这个问题，有点头大
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1楼 2013-11-26 21:34:51
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sinoer

铜虫 (小有名气)
gyesang: 屏蔽内容, 论坛没有广告！ 2013-11-27 01:40:08
本帖内容被屏蔽
2楼2013-11-26 23:16:13
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不一定是3的倍数；
移码与否与是否是3的倍数无关；
一般不要考虑，都会是IN FRAME;极个别情况要考虑是否IN FRAME
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3楼2013-11-27 01:20:22
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
箫箫客: 金币+1, ★有帮助 2013-12-01 11:48:36
引物的碱基数不一定是3的倍数啊，在你装完载体后，从你基因前的第一个ATG数到你基因ATG的时候，一定要是3的倍数，否则就移码，你装完载体，可以电子翻译一下试试看看你这么克隆是否会造成移码
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-11-27 01:42:46
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holyhawk

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 15:47:24
箫箫客: 金币+2, ★有帮助 2013-12-01 11:47:52
回答： 引物设计首先要针对你的实验目的。如果上载体，如果你的cDNA带有ATG，凡是没有N－端融合表达情况的，一般不用考虑3的倍数和ATG的问题。反之必须考虑ATG的情况，要保证不要出现移码问题，所以引物要考虑的因素要增加一个。多长倒不是大问题，配对区在18到20个左右，配对区TM合适，前面你想加多长理论上都可以。
          建议用TOPO系列的载体，真核原核表达的都可以，一步PCR，不用回收，不用酶切，直接上TOPO载体连接，5分钟后转化感受态细胞，第二天挑克隆，最多第三天酶切得到合适的克隆；测序一天，第五天得到正确的质粒。 差不多是一周的时间得到，同时细胞或动物，或细菌在这周空闲时间准备好了，下周可以直接上。呵呵。
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5楼2013-11-27 03:10:18
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swani

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 15:47:30
箫箫客: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-12-01 11:48:12
设计的引物如果涉及转录和翻译的必须考虑碱基3的倍数问题！这就像我们喝水的时候一定要考虑温度一样，但是你可以喝凉水也可以喝热水，根据具体的试验设计不同的引物，不一定必须是3的倍数，适合你的试验就好。
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6楼2013-11-27 06:54:00
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三蛰

铜虫 (小有名气)
不必
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我不会！
7楼2013-11-27 15:54:51
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zz53qq53

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不一定，一般有12碱基与模板保持配对，引物就会稳定结合在模板上，不会出现位置偏移
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8楼2013-11-27 16:24:21
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