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[求助]
设计引物装载体 求高手
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| 设计引物一定要保证是3的倍数吗？如果不是3的倍数会不会载入载体后会发生移码吗？一般把目的片段装入载体时会考虑载体上的移码而不会考虑获得的PCR序列，到底要不要考虑呀，突然想到这个问题，有点头大 |
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gyesang
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4楼2013-11-27 01:42:46
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2楼2013-11-26 23:16:13
zh10246
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3楼2013-11-27 01:20:22
【答案】应助回帖
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回答： 引物设计首先要针对你的实验目的。如果上载体，如果你的cDNA带有ATG，凡是没有N－端融合表达情况的，一般不用考虑3的倍数和ATG的问题。反之必须考虑ATG的情况，要保证不要出现移码问题，所以引物要考虑的因素要增加一个。多长倒不是大问题，配对区在18到20个左右，配对区TM合适，前面你想加多长理论上都可以。 建议用TOPO系列的载体，真核原核表达的都可以，一步PCR，不用回收，不用酶切，直接上TOPO载体连接，5分钟后转化感受态细胞，第二天挑克隆，最多第三天酶切得到合适的克隆；测序一天，第五天得到正确的质粒。 差不多是一周的时间得到，同时细胞或动物，或细菌在这周空闲时间准备好了，下周可以直接上。呵呵。 |
5楼2013-11-27 03:10:18
