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wanghd2826

铁虫 (小有名气)

[求助] 自设简并引物几对，请高手帮检查下~~~

刚开始学习简并引物的设计，看了几篇经典的帖子，受益匪浅，按照步骤尝试设计了几对，但是对于简并引物的检测还不是很有信心，比如退火温度、错配率等等如何协调到最优，希望各路虫友帮忙看下这几对合适不。
上5’-GCYGGITTYGARACITCITCNAC-3’      下5’-CCRAAICGCATNCCDATRCA-3’

上5’-GARACICTICGNAARTAYCCNC-3’      下5’-CCRAAICGIAGNCCDATRCA-3’

上5’-GCYGGITTYGARACITCITCNAC-3’     下5’-CGIGGNCCYTCNCCIAAIGG-3’

上5’-GARACICTICGNAARTAYCCNC-3’      下5’-CCRAAICGCATNCCDATRCA-3’
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1楼 2011-08-08 22:54:15
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励 2011-08-10 12:13:17
为什么简并点都设计在3‘末端，主要从3’末端开始延伸，这样容易错配，还有为什么都是A结尾啊，容易错配，简并数未免有点多
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2楼2011-08-09 10:02:13
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第五平原

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎讨论 2011-08-10 12:13:31
2楼说的对，3’的碱基以A结尾很容易引发错配，最好是能以T结尾，另外上下游引物之间CG含量和退火温度差异不要太大。
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勤勉
3楼2011-08-09 12:33:51
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2011-08-09 10:02:13:
为什么简并点都设计在3‘末端，主要从3’末端开始延伸，这样容易错配，还有为什么都是A结尾啊，容易错配，简并数未免有点多

多谢帮忙啊~
不过我看到许多文献中的3‘端也是简并的啊，这里确实有点不理解。我该怎么修改呢？
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4楼2011-08-10 09:53:09
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 第五平原 at 2011-08-09 12:33:51:
2楼说的对，3’的碱基以A结尾很容易引发错配，最好是能以T结尾，另外上下游引物之间CG含量和退火温度差异不要太大。

请问是不是简并引物的退火温度越高越好呢，例如在70度左右，还有就是我用PP5和Oligo6检测得到的退火温度不一样啊 差别还不小，应该用哪个软较好呢？
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5楼2011-08-10 09:55:06
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by wanghd2826 at 2011-08-10 09:53:09:
多谢帮忙啊~
不过我看到许多文献中的3‘端也是简并的啊，这里确实有点不理解。我该怎么修改呢？

只要3端的最后一个碱基不是兼并性的就可以了，没有关系的，我们得简并引物都是这样设计的！
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6楼2011-08-10 10:01:03
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-10 12:13:44
西瓜(金币+5): 学习了！很有经验呢！ 2011-08-10 17:56:19
wanghd2826(金币+15): 多谢指点，以后有不懂的地方再请教前辈！ 2011-08-11 23:16:14
西瓜: 漏了EPI，现在补上，抱歉哦！ 2011-08-12 00:15:54
西瓜(MolEPI+1): 2011-08-12 09:06:50
引用回帖:
5楼: Originally posted by wanghd2826 at 2011-08-10 09:55:06:
请问是不是简并引物的退火温度越高越好呢，例如在70度左右，还有就是我用PP5和Oligo6检测得到的退火温度不一样啊 差别还不小，应该用哪个软较好呢？

既然是简并引物，目的引物的序列是不确定的，你用软件检测是没有办法计算得到简并引物的TM值的，推荐使用Touch-down PCR程序，引物之间的TM差别大一点没有关系的，我们以前曾经计算过，利用简并引物扩增得到目的序列，测序以后发现两条引物之间的TM值差别达到15-20度，所以不要太纠结于简并引物的TM，只要注意引物的GC值不要太高和太低就可以了。
祝顺利！
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7楼2011-08-10 10:08:12
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-08-10 17:56:31
引用回帖:
4楼: Originally posted by wanghd2826 at 2011-08-10 09:53:09:
多谢帮忙啊~
不过我看到许多文献中的3‘端也是简并的啊，这里确实有点不理解。我该怎么修改呢？

往前挪动，避免在3‘端就好了，文献岂可全信
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8楼2011-08-10 10:46:33
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by love_st at 2011-08-10 10:46:33:
往前挪动，避免在3‘端就好了，文献岂可全信

对，文献里的引物有的是不靠谱啊，简并度高的可怕，但是老板非要说必须要用文献里的，另外自己再设计几对，郁闷。
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9楼2011-08-11 23:18:16
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jinkui960 at 2011-08-10 10:08:12:
既然是简并引物，目的引物的序列是不确定的，你用软件检测是没有办法计算得到简并引物的TM值的，推荐使用Touch-down PCR程序，引物之间的TM差别大一点没有关系的，我们以前曾经计算过，利用简并引物扩增得到目的 ...

多谢提供宝贵建议！ 我还想问下，简并引物一般简并度在多少以内比较合适呢，我看到有的文献（英文）简并引物简并度高的可怕。。另外，看到有帖子发到用CODEHOP方法设计简并引物，自己也尝试了几对，用的是在线CODEHOP设计的，不知道这种方法设计出的引物效果如何呢？
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10楼2011-08-11 23:23:36
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