应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR引物的量如何确定，求助高手指教
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
121/2返回列表12下一页
查看: 4224  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

13808906306

金虫 (正式写手)

[求助] PCR引物的量如何确定，求助高手指教 已有1人参与

最近做PCR发现一个问题，一些资料上说PCR体系中引物的量要稍大于模板的量，可是在PCR过程中引物不断被消耗，我计算了下十几二十几个循环后引物明显不够啊，比如我做的PCR  50ul 体系：引物1、2各为25 pmol ，模板量4 pmol ，我的是倍数扩增，按我的做法不到四个循，引物环就消耗干净了。可是我在实际操作中发现，PCR在第二十五、六个循环才出条带，这是为什么啊。求高人指点
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-02-23 15:37:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

13808906306

金虫 (正式写手)
坐等高人指点
回复此楼
2楼2012-02-23 15:40:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板量4 pmol 这个说法你是不是误解了？
假设模板为400bp的DNA片段1ng/ul，使用1ul作模板。在100ul体系中，
则模板量为0.01ng/ul换算出来即为0.037nM(而1nM=0.001pmol/ul，0.037nM=0.000037pmol/ul)
而引物为10pmol/ul使用1ul加到100的体系里也有0.1pmol/ul>>0.000037pmol/ul
赞一下 回复此楼
伟大航线....
3楼2012-02-23 16:36:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

13808906306

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by longrna at 2012-02-23 16:36:33:
模板量4 pmol 这个说法你是不是误解了？
假设模板为400bp的DNA片段1ng/ul，使用1ul作模板。在100ul体系中，
则模板量为0.01ng/ul换算出来即为0.037nM(而1nM=0.001pmol/ul，0.037nM=0.000037pmol/ul)
而引物为1 ...

木有误解啊，我是用紫外分光光度计测的浓度：14ug/ml ，片段长度为77bp（算出来大概就是0.56pmol/ul），然后取7ul做模板，差不多就是4pmol啊，然后引物是10uM的，也就是10pmol/ul，取2.5ul加入到50ul体系，也就是25pmol了
赞一下 回复此楼
4楼2012-02-23 16:50:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你算法有误吧
7ul模板（模板太多了）=7ul*14ng/ul=98ng 加入50ul体系 98ng/50ul=1.96ng/ul(算2ng/ul)
2ng/ul的 77bp DNA你怎么算成4pmol? 应该是40nM(即0.04pmol/ul，而不是4pmol)
赞一下 回复此楼
伟大航线....
5楼2012-02-23 16:59:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

13808906306

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2012-02-23 16:59:49:
你算法有误吧
7ul模板（模板太多了）=7ul*14ng/ul=98ng 加入50ul体系 98ng/50ul=1.96ng/ul(算2ng/ul)
2ng/ul的 77bp DNA你怎么算成4pmol? 应该是40nM(即0.04pmol/ul，而不是4pmol)

哥，你误解我了，我的DNA样品是14ng/ul，我加了7ul，你算算这7ul是不是3.92pmol，
赞一下 回复此楼
6楼2012-02-23 17:31:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)
肯定不是啦，你怎么算的？
赞一下 回复此楼
伟大航线....
7楼2012-02-23 17:40:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

海阔天空8158

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3): 呵呵 2012-02-24 10:51:54
这个问题与算法无关。
楼主，你的算法可能没错，但是，你忽略一个重要问题：你的DNA都是你的目的产物吗？肯定有许多其他无关序列的。
因此，计算没有丝毫意义。这也是平常做PCR的时候根本不会计算的原因。

即使能够定量。随着循环数的提高，引物的使用量非常惊人的。另外，只要确实有目的序列，那么使用标准算法没什么问题的。
赞一下 回复此楼
天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
8楼2012-02-24 08:26:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangwei2008

木虫 (职业作家)

小木虫之移花宫主
引用回帖:
8楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-02-24 08:26:25:
这个问题与算法无关。
楼主，你的算法可能没错，但是，你忽略一个重要问题：你的DNA都是你的目的产物吗？肯定有许多其他无关序列的。
因此，计算没有丝毫意义。这也是平常做PCR的时候根本不会计算的原因。

即 ...

这个兄弟貌似说的有道理
赞一下 回复此楼
9楼2012-02-24 10:32:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

13808906306

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 海阔天空8158 at 2012-02-24 08:26:25:
这个问题与算法无关。
楼主，你的算法可能没错，但是，你忽略一个重要问题：你的DNA都是你的目的产物吗？肯定有许多其他无关序列的。
因此，计算没有丝毫意义。这也是平常做PCR的时候根本不会计算的原因。

即 ...

这位说的有道理，但是我把PCR产物跑非变性PAGE凝胶发现确实是只有一条带，就算有杂的DNA相信亮也是很少的，所以我还是纠结我的问题，能给解答我的原始问题吗？
赞一下 回复此楼
10楼2012-02-24 15:34:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 13808906306 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿华东师范大学有机化学专业，初试351分，复试被刷求调剂! +5 真名有冰 2026-03-29 6/300 2026-03-29 20:53 by 唐沐儿
[考研] 317分 一志愿南理工材料工程 本科湖工大 求调剂 +10 芋泥小铃铛 2026-03-28 10/500 2026-03-29 20:51 by 无际的草原
[考研] 291求调剂 +7 Y-cap 2026-03-29 8/400 2026-03-29 19:53 by klasasda
[考研] 08工科求调剂286 +3 tgs_001 2026-03-28 3/150 2026-03-29 18:29 by 1018329917
[考研] 299求调剂 +10 15188958825 2026-03-25 10/500 2026-03-29 17:51 by 王亮_大连医科大
[考研] 332求调剂 +8 蕉蕉123 2026-03-28 8/400 2026-03-29 10:46 by 周梓丹
[考研] 279求调剂 +4 蝶舞轻绕 2026-03-29 4/200 2026-03-29 09:45 by laoshidan
[考研] 调剂考研 +3 王杰一 2026-03-29 3/150 2026-03-29 08:09 by fmesaito
[考研] 295求调剂 +4 wei-5 2026-03-26 4/200 2026-03-28 23:20 by 小木虫tim
[考研] 347求调剂 +3 山顶见α 2026-03-25 3/150 2026-03-28 14:13 by 唐沐儿
[考研] 药学105500求调剂 +3 Ssun。。 2026-03-28 3/150 2026-03-28 11:24 by lxf170613
[考研] 265求调剂11408 +3 刘小鹿lu 2026-03-27 3/150 2026-03-27 20:53 by nihaoar
[考研] 266求调剂 +11 阳阳哇塞 2026-03-27 12/600 2026-03-27 17:56 by yu221
[考研] 安徽大学专硕生物与医药专业(086000)324分，英语已过四六级，六级521，求调剂 +4 美味可乐鸡翅 2026-03-26 4/200 2026-03-27 15:27 by 星空星月
[考研] 求调剂 +3 刘柯@ 2026-03-24 4/200 2026-03-27 11:28 by shangxh
[考研] 321求调剂 +6 Ymlll 2026-03-24 6/300 2026-03-26 20:50 by 不吃魚的貓
[考研] 0703化学求调剂 +3 丹青奶盖 2026-03-26 5/250 2026-03-26 20:11 by macy2011
[考研] 上海电力大学材料防护与新材料重点实验室招收调剂研究生（材料、化学、电化学，环境） +4 我爱学电池 2026-03-23 4/200 2026-03-25 00:59 by 1027_324
[考研] 化工专硕求调剂 +3 question挽风 2026-03-24 3/150 2026-03-24 18:48 by jhhcooi
[考研] 292求调剂 +4 鹅鹅鹅额额额额� 2026-03-24 4/200 2026-03-24 16:41 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭