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13808906306

金虫 (正式写手)

[求助] PCR引物的量如何确定,求助高手指教 已有1人参与

最近做PCR发现一个问题,一些资料上说PCR体系中引物的量要稍大于模板的量,可是在PCR过程中引物不断被消耗,我计算了下十几二十几个循环后引物明显不够啊,比如我做的PCR  50ul 体系:引物1、2各为25 pmol ,模板量4 pmol ,我的是倍数扩增,按我的做法不到四个循,引物环就消耗干净了。可是我在实际操作中发现,PCR在第二十五、六个循环才出条带,这是为什么啊。求高人指点
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13808906306

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2012-02-23 16:59:49:
你算法有误吧
7ul模板(模板太多了)=7ul*14ng/ul=98ng 加入50ul体系 98ng/50ul=1.96ng/ul(算2ng/ul)
2ng/ul的 77bp DNA你怎么算成4pmol? 应该是40nM(即0.04pmol/ul,而不是4pmol)

哥,你误解我了,我的DNA样品是14ng/ul,我加了7ul,你算算这7ul是不是3.92pmol,
6楼2012-02-23 17:31:47
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13808906306

金虫 (正式写手)

坐等高人指点
2楼2012-02-23 15:40:46
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
模板量4 pmol 这个说法你是不是误解了?
假设模板为400bp的DNA片段1ng/ul,使用1ul作模板。在100ul体系中,
则模板量为0.01ng/ul换算出来即为0.037nM(而1nM=0.001pmol/ul,0.037nM=0.000037pmol/ul)
而引物为10pmol/ul使用1ul加到100的体系里也有0.1pmol/ul>>0.000037pmol/ul
伟大航线....
3楼2012-02-23 16:36:33
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13808906306

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by longrna at 2012-02-23 16:36:33:
模板量4 pmol 这个说法你是不是误解了?
假设模板为400bp的DNA片段1ng/ul,使用1ul作模板。在100ul体系中,
则模板量为0.01ng/ul换算出来即为0.037nM(而1nM=0.001pmol/ul,0.037nM=0.000037pmol/ul)
而引物为1 ...

木有误解啊,我是用紫外分光光度计测的浓度:14ug/ml ,片段长度为77bp(算出来大概就是0.56pmol/ul),然后取7ul做模板,差不多就是4pmol啊,然后引物是10uM的,也就是10pmol/ul,取2.5ul加入到50ul体系,也就是25pmol了
4楼2012-02-23 16:50:44
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