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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求帮忙分析下菌液PCR检测结果
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] 求帮忙分析下菌液PCR检测结果

各位同志，图是我挑选单克隆之后菌液PCR的结果，上半部分为一个基因大小2168bp，下半部分基因大小1527bp。从图上看，只有基因2只有2.5可能有目的条带，基因6中6.2.1-6.2.5均有1500bp左右片段，但亮度不够。最近的单克隆经常出现这种情况，要么亮度不够，要么不是目的条带，请各位大侠帮忙分析下出现这种情况的原因及可能的解决办法，不胜感激。
ps：连接的目的基因是通过PCR扩增、切胶回收得到，连接前电泳检测过，条带单一。
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1楼 2011-10-08 19:57:15
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wen19870427

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-10-08 21:29:45
检测基因6用的引物不够特异，重新设计引物
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2楼2011-10-08 20:48:03
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

情况比较复杂，干脆提下质粒重新p下好了
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3楼2011-10-08 21:12:01
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小强哥

禁言 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
4楼2011-10-08 21:33:26
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双鱼猫咪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-10-09 07:57:33
请问检测的用的是特异引物还是通用引物，如果是通用引物，P出来的片段会比目的片段稍大一点。菌液PCR本身假阳性就很高，最好用质粒PCR，结合酶切鉴定，会使成功率提高
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5楼2011-10-08 21:55:48
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 鼓励，可以开专贴，单独讨论下，集思广益 2011-10-09 07:58:13
faile18(金币+10): 2011-10-09 21:22:56
我之前探讨过类似的问题了，今天在小议一下：

1. 楼主的问题说的不是很清楚。用的是什么载体？菌液PCR是如何选用引物的？退火温度是怎么选择的？
   这种电泳结果说明，你的引物特异性不是很高，引物可能在转化菌株的基因组上又结合位点。上面那个图中，有你要的目的条带，但是有些条带不是很清楚，原因可能很多，如模板量、DNA聚合酶用量的差异的等。这个可以不用管，这个实验是有和无的关系，可以选三个有目的带的样品测序，最终结果是以测序为准的，菌体PCR只是初步筛选的过程。
   
   2. 感觉是你引物选用的不对。我们常用的载体上都用通用的测序引物（如如M13F、M13R、T7、Sp6等，若真没有，可以自行设计一条20bp左右的引物），可以和你目的片段的一条引物配对，这个可以以没有外源片段的载体作对照，这样获得的结果可行对比较高。不能直接用扩增你目的片段的方法，没有说服力；

   3. 菌体电泳，直接用碱裂解法的溶液I和溶液II裂解菌体后，进行电泳，以没有外源片段的载体作对照，条带相对滞后样品就是应该是连入外源片段的。

   4. 可以酶切载体，再以没有连接外源片段载体的酶切产物作对照。这个方法比较麻烦，不推荐。

    通过这几种方法筛选到的阳性克隆，直接以菌体送去测序公司测序分析。你所要的阳性克隆，最终还是要通过测序结果的序列分析确定。
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6楼2011-10-08 22:03:39
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haijyang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-10-09 07:58:22
直接以菌液为模板通过PCR扩增目的基因来检测连接情况很简单，建议设计引物，扩增片段小一点，PCR用25微升体系，1微升模板就可以了
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7楼2011-10-08 22:29:27
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wen19870427 at 2011-10-08 20:48:03:
检测基因6用的引物不够特异，重新设计引物

可能是特异性不够，但是PCR扩增的时候扩出来的条带是单一的
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8楼2011-10-09 21:02:36
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by haijyang at 2011-10-08 22:29:27:
直接以菌液为模板通过PCR扩增目的基因来检测连接情况很简单，建议设计引物，扩增片段小一点，PCR用25微升体系，1微升模板就可以了

我也了解整个操作过程及原理比较简单，但是我做出来的就是这样的结果，而且类似的其他基因也出现这种情况，我体系用的是20微升，模板1微升
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9楼2011-10-09 21:04:20
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by aayqaa at 2011-10-08 21:12:01:
情况比较复杂，干脆提下质粒重新p下好了

提取质粒检测效果要好一些吗？
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10楼2011-10-09 21:05:36
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