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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求帮忙分析下菌液PCR检测结果
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asznpb

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by faile18 at 2011-10-09 21:05:36:
提取质粒检测效果要好一些吗？

那是必然了，肯定能排除基因组的影响啊！特别是针对特异性不高的引物而言
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显微镜下的世界很精彩！
11楼2011-10-09 21:09:06
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 双鱼猫咪 at 2011-10-08 21:55:48:
请问检测的用的是特异引物还是通用引物，如果是通用引物，P出来的片段会比目的片段稍大一点。菌液PCR本身假阳性就很高，最好用质粒PCR，结合酶切鉴定，会使成功率提高

关于引物，是我自己设计的，可能特异性不高，我是用的普通PCR扩增时用的引物，单克隆我是通过蓝白斑筛选的，实验室的其他人说他们挑出来的一般都是阳性的，质粒PCR效果要好一些吗？
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12楼2011-10-09 21:09:53
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bioartist at 2011-10-08 22:03:39:
我之前探讨过类似的问题了，今天在小议一下：

1. 楼主的问题说的不是很清楚。用的是什么载体？菌液PCR是如何选用引物的？退火温度是怎么选择的？
   这种电泳结果说明，你的引物特异性不是很高，引物可能在转 ...

谢谢您的回复及帮助。关于载体我用的是宝生物的PUC19-T载体，整个连接用的是他们的试剂盒。菌液PCR的引物与普通PCR相同，都是我设计的扩增基因的，退火温度及反应体系也与扩增基因的相同。
关于送测序的问题，同课题组的同学说亮度不高的，送出去测序的意义不大，我就没有考虑。
引物是我自己设计的，由于是第一次，可能有点问题，确实是特异性不够高，但是是以回收的片段进行连接的，这个还是单一的，不知道为什么出现这么多杂带
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13楼2011-10-09 21:20:30
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by asznpb at 2011-10-09 21:09:06:
那是必然了，肯定能排除基因组的影响啊！特别是针对特异性不高的引物而言

你说的基因组的影响是指？我的引物确实特异性不够高
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14楼2011-10-09 21:21:03
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asznpb

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by faile18 at 2011-10-09 21:21:03:
你说的基因组的影响是指？我的引物确实特异性不够高

细菌的遗传物质包括细菌本身的基因组（或者不严格的叫染色体）还有就是游离的质粒，你的叙述中显然是要鉴定质粒？那么就需要提基因组了，你的引物的特异性不高，这一步是必须的
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显微镜下的世界很精彩！
15楼2011-10-09 21:23:51
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haijyang

金虫 (小有名气)
可以提一下质粒，跑电泳和空白质粒对照
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16楼2011-10-09 21:26:32
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by asznpb at 2011-10-09 21:23:51:
细菌的遗传物质包括细菌本身的基因组（或者不严格的叫染色体）还有就是游离的质粒，你的叙述中显然是要鉴定质粒？那么就需要提基因组了，你的引物的特异性不高，这一步是必须的

好的， 谢谢您的回复，我明天做一下这部分
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17楼2011-10-09 21:39:32
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by haijyang at 2011-10-09 21:26:32:
可以提一下质粒，跑电泳和空白质粒对照

谢谢您的帮助，准备着手开工了
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18楼2011-10-09 21:39:53
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qj900302

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2282128楼: Originally posted by bioartist at 2011-10-08 22:03:39
我之前探讨过类似的问题了，今天在小议一下：

1. 楼主的问题说的不是很清楚。用的是什么载体？菌液PCR是如何选用引物的？退火温度是怎么选择的？
   这种电泳结果说明，你的引物特异性不是很高，引物可能在转化 ...

我是新手 想问一下怎么样裂解菌体成为模板啊？
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19楼2012-09-28 22:42:05
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
引用回帖:
4697231楼: Originally posted by qj900302 at 2012-09-28 22:42:05
我是新手 想问一下怎么样裂解菌体成为模板啊？...

我建议，在平板上多挑取一些单克隆，用1.0ml LB液体培养基在1.5ml Ep管中培养10-15h（摇床培养时，最好倒置Ep管），然后取1-2ul做模板常规PCR扩增。
对于E.coli，只要在PCR程序的第一变性时间延长5min就可以了裂解菌体。

有问题，可以随时和我联系。谢谢。
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20楼2012-10-01 17:23:19
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