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faile18

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[求助] 求帮忙分析下菌液PCR检测结果

各位同志，图是我挑选单克隆之后菌液PCR的结果，上半部分为一个基因大小2168bp，下半部分基因大小1527bp。从图上看，只有基因2只有2.5可能有目的条带，基因6中6.2.1-6.2.5均有1500bp左右片段，但亮度不够。最近的单克隆经常出现这种情况，要么亮度不够，要么不是目的条带，请各位大侠帮忙分析下出现这种情况的原因及可能的解决办法，不胜感激。
ps：连接的目的基因是通过PCR扩增、切胶回收得到，连接前电泳检测过，条带单一。

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1楼 2011-10-08 19:57:15

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faile18

金虫 (小有名气)

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引用回帖:

6楼: Originally posted by bioartist at 2011-10-08 22:03:39:
我之前探讨过类似的问题了，今天在小议一下：

1. 楼主的问题说的不是很清楚。用的是什么载体？菌液PCR是如何选用引物的？退火温度是怎么选择的？
这种电泳结果说明，你的引物特异性不是很高，引物可能在转 ...

谢谢您的回复及帮助。关于载体我用的是宝生物的PUC19-T载体，整个连接用的是他们的试剂盒。菌液PCR的引物与普通PCR相同，都是我设计的扩增基因的，退火温度及反应体系也与扩增基因的相同。
关于送测序的问题，同课题组的同学说亮度不高的，送出去测序的意义不大，我就没有考虑。
引物是我自己设计的，由于是第一次，可能有点问题，确实是特异性不够高，但是是以回收的片段进行连接的，这个还是单一的，不知道为什么出现这么多杂带