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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 鼓励，可以开专贴，单独讨论下，集思广益 2011-10-09 07:58:13
faile18(金币+10): 2011-10-09 21:22:56

我之前探讨过类似的问题了，今天在小议一下：

1. 楼主的问题说的不是很清楚。用的是什么载体？菌液PCR是如何选用引物的？退火温度是怎么选择的？
这种电泳结果说明，你的引物特异性不是很高，引物可能在转化菌株的基因组上又结合位点。上面那个图中，有你要的目的条带，但是有些条带不是很清楚，原因可能很多，如模板量、DNA聚合酶用量的差异的等。这个可以不用管，这个实验是有和无的关系，可以选三个有目的带的样品测序，最终结果是以测序为准的，菌体PCR只是初步筛选的过程。

2. 感觉是你引物选用的不对。我们常用的载体上都用通用的测序引物（如如M13F、M13R、T7、Sp6等，若真没有，可以自行设计一条20bp左右的引物），可以和你目的片段的一条引物配对，这个可以以没有外源片段的载体作对照，这样获得的结果可行对比较高。不能直接用扩增你目的片段的方法，没有说服力；

3. 菌体电泳，直接用碱裂解法的溶液I和溶液II裂解菌体后，进行电泳，以没有外源片段的载体作对照，条带相对滞后样品就是应该是连入外源片段的。

4. 可以酶切载体，再以没有连接外源片段载体的酶切产物作对照。这个方法比较麻烦，不推荐。

通过这几种方法筛选到的阳性克隆，直接以菌体送去测序公司测序分析。你所要的阳性克隆，最终还是要通过测序结果的序列分析确定。

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6楼2011-10-08 22:03:39

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