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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液pcr检测不对
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qyqy512

铜虫 (初入文坛)

[求助] 菌液pcr检测不对

最近做连接，菌液pcr检测条带不对，目的条带是2000左右，菌液pcr出来是1000，做了两次连接，都是这样的结果。求助高手啊
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1楼2011-05-28 15:33:59
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 鼓励 2011-05-28 19:30:15
1：载体和基因酶切是否完全呢？可以上图看看
2：连接体系如何？时间呢？
3：感受态细胞的活性呢？
4：也不定用菌液做，可以用划到板子上的菌裂解后当模板的；
5：上图，我来看看。如果没有连接上，应该不会有条带的，为什么还会P出来一条1000bp的条带呢？难道是非特异性的？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-05-28 15:37:34
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qyqy512

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-28 15:37:34:
1：载体和基因酶切是否完全呢？可以上图看看
2：连接体系如何？时间呢？
3：感受态细胞的活性呢？
4：也不定用菌液做，可以用划到板子上的菌裂解后当模板的；
5：上图，我来看看。如果没有连接上，应该不会有 ...

感受态应该没问题，做别的基因都好，直接连TA克隆过夜，没有酶切。
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3楼2011-05-28 15:55:10
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 连续鼓励 2011-05-28 19:30:26
引用回帖:
Originally posted by qyqy512 at 2011-05-28 15:55:10:
感受态应该没问题，做别的基因都好，直接连TA克隆过夜，没有酶切。



TA克隆可以不用酶切吗？
还有你的电泳图给标注一下撒。。。
我给你的回复，你排除一下可能的情况。。。
一般就是那几个问题的。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-05-28 16:12:17
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qyqy512

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-28 16:12:17:
TA克隆可以不用酶切吗？
还有你的电泳图给标注一下撒。。。
我给你的回复，你排除一下可能的情况。。。
一般就是那几个问题的。

那几个方法我之前也有想到，也一一排除过了，只有那个划板的方法我之前都没做过，电泳图上面的是目的片段cDNA PCR，下面的是菌液pcr。我质粒提出来酶切是糊的，没有目的条带。
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5楼2011-05-28 16:26:45
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

个人经验，你的目的条带没有克隆成功，建议重新pcr，富集目的条带后重新TA克隆，链接是最好过夜
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6楼2011-05-29 23:43:11
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andy99990000

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
qyqy512(金币+1): 谢谢 2011-05-30 08:34:00
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good！对楼主有帮助！经决定，授予专家指数。 2011-09-24 08:48:00
楼主可以提供下克隆载体的大小吗？如果我估计的没错，应该是空载的假阳性（or 只转化进了极少目的片段，所以能够用你的特异引物扩增），测序后就是你的载体片段。
这种情况我遇到过，我当时的PCR目的片段1200bp，但是最后筛选出来，1000bp和1200bp都有，我当时以为片段在不同种中的差异很大，就都测序了一些。结果1000bp的是空载的假阳性。
建议楼主也可以送一两个样测测序，毕竟也不贵。再就是优化连接及转化条件，减少假阳性的概率。
个人经验，希望有所帮助~~
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7楼2011-05-30 00:13:42
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herethere

铁虫 (文坛精英)
质粒酶切没有目的条带那就是没有克隆成功了，连接16℃过夜，用的也是pucm-t vector还是其他的。。。
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The future belongs to those who believe in the beauty of their dreams
8楼2011-09-23 20:26:54
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