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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建成功下一步遇难
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[求助] 载体构建成功下一步遇难

好不容易构建成功了一个载体，在把提取的质粒导入表达受体细胞，涂卡那抗性的板长出菌落，但挑取菌落用液体培养基培养，做菌液PCR检测目的基因条带时，却没有条带出现。请问各位高手这是怎么回事？是质粒没导进去？还是质粒丢失了呢？
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1楼 2011-10-04 16:46:03
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

或者你可以试下提质粒后再PCR，这样的PCR好做一点。
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2楼2011-10-04 19:32:42
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红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-10-05 17:36:12
呵呵，你是不是用的PET载体啊
1.看清楚你用的感受态细胞能不能接受这类的的载体哦，Origami™ B系列的菌对kan是不敏感的，如果你实在需要保证蛋白二硫键的形成，可以考虑换成Origami™ 2系列的感受态。
2.如果你确定了不是宿主菌和载体匹配性问题，那么很可能是载体丢失了，你摇菌的时候加入了kan没，如果没加，问题大概就出这里了。
3.你挑取的菌落应该做一个菌落PCR，确保不做无用功，因为单靠抗生素筛选，貌似假阳性很高的耶。
我最近也在做表达，多多交流 嘿嘿
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可以用QQ找我……
3楼2011-10-04 22:42:03
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 红多多 at 2011-10-04 22:42:03:
呵呵，你是不是用的PET载体啊
1.看清楚你用的感受态细胞能不能接受这类的的载体哦，Origami™ B系列的菌对kan是不敏感的，如果你实在需要保证蛋白二硫键的形成，可以考虑换成Origami™ 2系列的感受态。 ...

我选用的是PET28a载体，受体细胞是大肠杆菌BL21（DE）,见有文献是这么用的，不知道用在我这里适不适合。 什么抗性不是针对载体来说的吗，载体是kan抗性的，那么菌体不应该抗kan吗？ 是这样吗？ 请多指教！
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4楼2011-10-05 08:26:39
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

这种情况太正常了，有可能是你没有连接成功！
做一个PCR验证就行了。。。如果不对继续做。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-10-05 09:32:28
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 天使托 at 2011-10-05 09:32:28:
这种情况太正常了，有可能是你没有连接成功！
做一个PCR验证就行了。。。如果不对继续做。。。

验证过连接成功了，才提前质粒导入到表达受体细胞中啊。
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6楼2011-10-05 10:40:18
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红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子

【答案】应助回帖

暗夜懒猫(金币+2): 2011-10-05 15:26:29
用商品话的载体做阳性对照，检测感受态细胞的活性。
用空载感受态细胞涂kan板，确保BL21(DE3)没受到其他质粒污染。
更换提取质粒方法试试，质粒组分不纯可能影响细胞转化。
祝你成功
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可以用QQ找我……
7楼2011-10-05 10:53:22
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