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【求助/交流】求构载体高手 赐教构建亚细胞定位载体pCAMBIA1302
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最近要做一个亚细胞定位实验 载体信息如下： 用于植物转基因的双元转化载体. 主要用途，以gfp为基础的分子定位 检测rbcs的导肽对蛋白定位的作用 插入使用说明： gfp:的阅读框在酶切位点上的分布如下： NcoI-----BglII----- SpeI CC ATG GtA GAT CTg ACT AGT aaa gga gaa ga ---M---V---D---L---T-- S-- K-- G-- E-- X 由于我的基因ORF内部有bgl II位点 所以只能选择Nco I 和SpeI 但是我的基因阅读框起始密码子位置是这样的 CCATGGG ，加粗部分是我的起始密码子，本身构成了一个NcoI位点，所以我在设计引物的时候就把CC换成了其他碱基如AT。 但是我现在有一个问题没有弄清楚，就是从35S启动子往下算的第一个碱基到我的ATG起始密码子这一段是不是必须是3的倍数，由于NcoI本身存在一个ATG，我应该怎么设计引物才会编码出正确的蛋白呢？ 我今天设计了一条引物 正向的：图三，我现在就是不知道这个起始密码子到35S启动子末这段是怎么算的。 分子生物学没学到家，哎！    [ Last edited by lxjwishes on 2011-3-2 at 20:48 ] |
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载体使用信息:--------------------------------------------------------------------------- 用于植物转基因的双元转化载体. 筛选标记:潮霉素 主要用途，以gfp为基础的分子定位 检测rbcs的导肽对蛋白定位的作用 插入使用说明： gfp:的阅读框在酶切位点上的分布如下： NcoI-----BglII----- SpeI CC ATG GtA GAT CTg ACT AGT aaa gga gaa ga ---M---V---D---L---T-- S-- K-- G-- E-- X sp：Ama signal序列： 1 MAKRIASMSS LLLIALLCLS SHLAQAQVL --> GFP的蛋白序列： --> 1 DLTSKGEELF TGVVPILVEL DGDVNGHKFS VSGEGEGDAT YGKLTLKFIC 51 TTGKLPVPWP TLVTTFSYGV QCFSRYPDHM KRHDFFKSAM PEGYVQERTI 101 FFKDDGNYKT RAEVKFEGDT LVNRIELKGI DFKEDGNILG HKLEYNYNSH 151 NVYIMADKQK NGIKANFKTR HNIEDGGVQL ADHYQQNTPI GDGPVLLPDN 201 HYLSTQSALS KDPNEKRDHM VLLEFVTAAG ITHGMDELYK ASHHHHX --> sp_gfp序列： 构建方案采取NcoI 和 SpeI连接结果正确。 --> 1 MAKRIASMSS LLLIALLCLS SHLAQAQVLT SKGEELFTGV VPILVELDGD 51 VNGHKFSVSG EGEGDATYGK LTLKFICTTG KLPVPWPTLV TTFSYGVQCF 101 SRYPDHMKRH DFFKSAMPEG YVQERTIFFK DDGNYKTRAE VKFEGDTLVN 151 RIELKGIDFK EDGNILGHKL EYNYNSHNVY IMADKQKNGI KANFKTRHNI 201 EDGGVQLADH YQQNTPIGDG PVLLPDNHYL STQSALSKDP NEKRDHMVLL 251 EFVTAAGITH GMDELYKASH HHHX --> 载体设计： AmaspNocI+: CAT CCATGG ATGGCAAAGCGCATAGCCTC 66/58℃ AmaspSpeI-: CTC ACTAGT GAGGACCTGGGCTTGGGC 66/60℃ ----------------------------------------------------------------------------------------------- 附：O.sativa alpha-amylase (alpha-Amy3) gene LOCUS RICAMYA 1317 bp DNA linear PLN 27-APR-1993 DEFINITION O.sativa alpha-amylase (alpha-Amy3) gene, complete cds. ACCESSION M24941 VERSION M24941.1 GI:169774 KEYWORDS alpha-amylase; alpha-amylase 3. SOURCE Oryza sativa (rice) ORGANISM Oryza sativa Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Poales; Poaceae; BEP clade; Ehrhartoideae; Oryzeae; Oryza. REFERENCE 1 (bases 1 to 1317) AUTHORS Sutliff,T.D., Huang,N. and Rodriguez,R.L. TITLE Isolation and characterization of a rice alpha-amylase multigene locus JOURNAL Unpublished (1989) COMMENT Original source text: O.stativa (strain cv. M202; EMBL4 library) leaf DNA. Draft entry and computer-readable sequence for [1] kindly submitted by T.D.Sutliff, 26-MAY-1989. FEATURES Location/Qualifiers source 1..1317 /organism="Oryza sativa" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:4530" CDS 1..1317 /note="alpha-amylase precursor (EC 3.2.1.1)" /codon_start=1 /protein_id="AAA33897.1" /db_xref="GI:169775" /translation="MAKRIASMSSLLLIALLCLSSHLAQAQVLFQGFNWESWKKQGGW YNFLHGHVDDIAATGVTHVWLPPPSHSVAPQGYMPGRLYDLDASKYGTGAELRSLIAA FHSKGIKCVADIVINHRCADYKDSRGIYCIFEGGTPDSRLDWGPDMICSDDTQYSNGR GHRDTGADFGAAPDIDHLNTRVQTELSDWLNWLKSDVGFDGWRLDFAKGYSAAVAKTY VDNTDPSFVVAEIWSNMRYDGNGEPSWNQDGDRQELVNWAQAVGGPASAFDFTTKGEL QAAVQGELWRMKDGNGKAPGMIGWLPEKAVTFIDNHDTGSTQNSWPFPSDKVMQGYAY ILTHPGVPCIFYDHVFDWNLKQEISTLAAVRSRNEIHPGSKLKILAAEGDVYVAMIDD KVITKIGTRYDVGNLIPSDFHVVAHGNNYCIWEKSGLRVPAGRHHY" sig_peptide 1..78 /note="alpha-amylase signal peptide" mat_peptide 76..1314 /product="alpha-amylase" ORIGIN Unreported. 1 atggcaaagc gcatagcctc aatgagcagc ctcctcctta tcgccttgct ctgtctgagc 61 tctcacttgg cccaagccca ggtcctcttc caggggttca actgggagtc gtggaagaag 121 cagggcgggt ggtacaactt cctccatggc cacgtcgacg acatcgccgc gaccggtgtc 181 acgcacgtct ggctcccacc gccgtcgcac tccgtcgccc cgcagggata catgccgggc 241 cggctctacg acctggacgc ttccaagtac ggcacggggg cagagctcag gtcgctgatc 301 gccgccttcc acagcaaagg catcaagtgc gtcgccgaca tcgtcatcaa ccaccggtgc 361 gcggattaca aggatagccg tggcatctac tgcattttcg agggtggcac gccggacagc 421 cgcctcgact ggggccccga catgatctgc agcgacgaca cgcagtactc caacggccgc 481 ggtcaccgcg acaccggcgc agacttcggc gcggcgcccg acatcgacca cctcaacacg 541 cgtgtgcaga cagagctgtc cgactggctc aattggctca agtccgacgt cggcttcgac 601 ggctggcgcc tcgacttcgc caagggatac tcggcggccg tcgccaagac gtacgtcgac 661 aacaccgacc cgtccttcgt cgtcgccgag atatggagca acatgcgtta cgacggcaac 721 ggtgagccgt cgtggaacca ggacggtgac cggcaggagc tggtgaactg ggcgcaggcc 781 gtcggtggcc ctgcgtcagc gttcgacttc acgaccaagg gcgagctgca ggcggcggtg 841 caaggtgagc tgtggcggat gaaggacggc aacggcaagg cgccggggat gattggctgg 901 ctgccagaga aggccgtcac cttcatcgac aaccatgaca ctggctccac acagaactca 961 tggccgttcc cctccgacaa ggtcatgcag ggctacgcct acatcctcac acaccctgga 1021 gtaccctgca ttttctacga ccatgtattt gactggaacc tgaagcagga gatcagcaca 1081 ttagctgcag tgagatcaag aaatgagatt catcccggga gcaagctgaa aatccttgct 1141 gctgagggag acgtctatgt cgccatgatc gatgataagg tcataacaaa gattgggaca 1201 cggtatgacg tgggcaactt aatcccgtca gacttccatg tcgttgctca cggcaacaat 1261 tactgcattt gggaaaagag cggtctcaga gttcctgcag ggcggcacca ctattag // |
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