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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求构载体高手 赐教构建亚细胞定位载体pCAMBIA1302
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lxjwishes

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】求构载体高手 赐教构建亚细胞定位载体pCAMBIA1302

最近要做一个亚细胞定位实验
载体信息如下：
用于植物转基因的双元转化载体.
主要用途，以gfp为基础的分子定位
检测rbcs的导肽对蛋白定位的作用
插入使用说明：
gfp:的阅读框在酶切位点上的分布如下：
NcoI-----BglII----- SpeI
CC ATG GtA GAT CTg ACT AGT aaa gga gaa ga
---M---V---D---L---T-- S-- K-- G-- E-- X


由于我的基因ORF内部有bgl II位点 所以只能选择Nco I 和SpeI
但是我的基因阅读框起始密码子位置是这样的 CCATGGG ，加粗部分是我的起始密码子，本身构成了一个NcoI位点，所以我在设计引物的时候就把CC换成了其他碱基如AT。
但是我现在有一个问题没有弄清楚，就是从35S启动子往下算的第一个碱基到我的ATG起始密码子这一段是不是必须是3的倍数，由于NcoI本身存在一个ATG，我应该怎么设计引物才会编码出正确的蛋白呢？

我今天设计了一条引物
正向的：图三，我现在就是不知道这个起始密码子到35S启动子末这段是怎么算的。

分子生物学没学到家，哎！






[ Last edited by lxjwishes on 2011-3-2 at 20:48 ]
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1楼 2011-03-02 20:47:07
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lxjwishes

银虫 (正式写手)
载体使用信息:---------------------------------------------------------------------------


用于植物转基因的双元转化载体.
筛选标记:潮霉素
主要用途，以gfp为基础的分子定位
检测rbcs的导肽对蛋白定位的作用
插入使用说明：
gfp:的阅读框在酶切位点上的分布如下：
NcoI-----BglII----- SpeI
CC ATG GtA GAT CTg ACT AGT aaa gga gaa ga
---M---V---D---L---T-- S-- K-- G-- E-- X
sp：Ama signal序列：
1 MAKRIASMSS LLLIALLCLS SHLAQAQVL
-->
GFP的蛋白序列：
-->
1 DLTSKGEELF TGVVPILVEL DGDVNGHKFS VSGEGEGDAT YGKLTLKFIC
51 TTGKLPVPWP TLVTTFSYGV QCFSRYPDHM KRHDFFKSAM PEGYVQERTI
101 FFKDDGNYKT RAEVKFEGDT LVNRIELKGI DFKEDGNILG HKLEYNYNSH
151 NVYIMADKQK NGIKANFKTR HNIEDGGVQL ADHYQQNTPI GDGPVLLPDN
201 HYLSTQSALS KDPNEKRDHM VLLEFVTAAG ITHGMDELYK ASHHHHX
-->
sp_gfp序列：
构建方案采取NcoI 和 SpeI连接结果正确。
-->
1 MAKRIASMSS LLLIALLCLS SHLAQAQVLT SKGEELFTGV VPILVELDGD
51 VNGHKFSVSG EGEGDATYGK LTLKFICTTG KLPVPWPTLV TTFSYGVQCF
101 SRYPDHMKRH DFFKSAMPEG YVQERTIFFK DDGNYKTRAE VKFEGDTLVN
151 RIELKGIDFK EDGNILGHKL EYNYNSHNVY IMADKQKNGI KANFKTRHNI
201 EDGGVQLADH YQQNTPIGDG PVLLPDNHYL STQSALSKDP NEKRDHMVLL
251 EFVTAAGITH GMDELYKASH HHHX
-->
载体设计：
AmaspNocI+: CAT CCATGG ATGGCAAAGCGCATAGCCTC 66/58℃
AmaspSpeI-: CTC ACTAGT GAGGACCTGGGCTTGGGC 66/60℃
-----------------------------------------------------------------------------------------------
附：O.sativa alpha-amylase (alpha-Amy3) gene
LOCUS RICAMYA 1317 bp DNA linear PLN 27-APR-1993
DEFINITION O.sativa alpha-amylase (alpha-Amy3) gene, complete cds.
ACCESSION M24941
VERSION M24941.1 GI:169774
KEYWORDS alpha-amylase; alpha-amylase 3.
SOURCE Oryza sativa (rice)
ORGANISM Oryza sativa
Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta;
Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Poales; Poaceae; BEP
clade; Ehrhartoideae; Oryzeae; Oryza.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1317)
AUTHORS Sutliff,T.D., Huang,N. and Rodriguez,R.L.
TITLE Isolation and characterization of a rice alpha-amylase multigene
locus
JOURNAL Unpublished (1989)
COMMENT Original source text: O.stativa (strain cv. M202; EMBL4 library)
leaf DNA.
Draft entry and computer-readable sequence for [1] kindly submitted
by T.D.Sutliff, 26-MAY-1989.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1317
/organism="Oryza sativa"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:4530"
CDS 1..1317
/note="alpha-amylase precursor (EC 3.2.1.1)"
/codon_start=1
/protein_id="AAA33897.1"
/db_xref="GI:169775"
/translation="MAKRIASMSSLLLIALLCLSSHLAQAQVLFQGFNWESWKKQGGW
YNFLHGHVDDIAATGVTHVWLPPPSHSVAPQGYMPGRLYDLDASKYGTGAELRSLIAA
FHSKGIKCVADIVINHRCADYKDSRGIYCIFEGGTPDSRLDWGPDMICSDDTQYSNGR
GHRDTGADFGAAPDIDHLNTRVQTELSDWLNWLKSDVGFDGWRLDFAKGYSAAVAKTY
VDNTDPSFVVAEIWSNMRYDGNGEPSWNQDGDRQELVNWAQAVGGPASAFDFTTKGEL
QAAVQGELWRMKDGNGKAPGMIGWLPEKAVTFIDNHDTGSTQNSWPFPSDKVMQGYAY
ILTHPGVPCIFYDHVFDWNLKQEISTLAAVRSRNEIHPGSKLKILAAEGDVYVAMIDD
KVITKIGTRYDVGNLIPSDFHVVAHGNNYCIWEKSGLRVPAGRHHY"
sig_peptide 1..78
/note="alpha-amylase signal peptide"
mat_peptide 76..1314
/product="alpha-amylase"
ORIGIN Unreported.
1 atggcaaagc gcatagcctc aatgagcagc ctcctcctta tcgccttgct ctgtctgagc
61 tctcacttgg cccaagccca ggtcctcttc caggggttca actgggagtc gtggaagaag
121 cagggcgggt ggtacaactt cctccatggc cacgtcgacg acatcgccgc gaccggtgtc
181 acgcacgtct ggctcccacc gccgtcgcac tccgtcgccc cgcagggata catgccgggc
241 cggctctacg acctggacgc ttccaagtac ggcacggggg cagagctcag gtcgctgatc
301 gccgccttcc acagcaaagg catcaagtgc gtcgccgaca tcgtcatcaa ccaccggtgc
361 gcggattaca aggatagccg tggcatctac tgcattttcg agggtggcac gccggacagc
421 cgcctcgact ggggccccga catgatctgc agcgacgaca cgcagtactc caacggccgc
481 ggtcaccgcg acaccggcgc agacttcggc gcggcgcccg acatcgacca cctcaacacg
541 cgtgtgcaga cagagctgtc cgactggctc aattggctca agtccgacgt cggcttcgac
601 ggctggcgcc tcgacttcgc caagggatac tcggcggccg tcgccaagac gtacgtcgac
661 aacaccgacc cgtccttcgt cgtcgccgag atatggagca acatgcgtta cgacggcaac
721 ggtgagccgt cgtggaacca ggacggtgac cggcaggagc tggtgaactg ggcgcaggcc
781 gtcggtggcc ctgcgtcagc gttcgacttc acgaccaagg gcgagctgca ggcggcggtg
841 caaggtgagc tgtggcggat gaaggacggc aacggcaagg cgccggggat gattggctgg
901 ctgccagaga aggccgtcac cttcatcgac aaccatgaca ctggctccac acagaactca
961 tggccgttcc cctccgacaa ggtcatgcag ggctacgcct acatcctcac acaccctgga
1021 gtaccctgca ttttctacga ccatgtattt gactggaacc tgaagcagga gatcagcaca
1081 ttagctgcag tgagatcaag aaatgagatt catcccggga gcaagctgaa aatccttgct
1141 gctgagggag acgtctatgt cgccatgatc gatgataagg tcataacaaa gattgggaca
1201 cggtatgacg tgggcaactt aatcccgtca gacttccatg tcgttgctca cggcaacaat
1261 tactgcattt gggaaaagag cggtctcaga gttcctgcag ggcggcacca ctattag
//
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4楼2011-03-02 22:15:26
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木虫 (正式写手)
lxjwishes(金币+1): 不替换gfp，是融合表达！ 2011-03-02 21:20:03
怎么做rbcs的导肽对蛋白定位的作用啊?
是要替换GFP序列吗？还是插入一部分。不明白。等高手出现。
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2楼2011-03-02 21:15:16
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木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxjwishes at 2011-03-02 20:47:07:
最近要做一个亚细胞定位实验
载体信息如下：
用于植物转基因的双元转化载体.
主要用途，以gfp为基础的分子定位
检测rbcs的导肽对蛋白定位的作用
插入使用说明：
gfp:的阅读框在酶切位点上的分布如下：
Nco ...

1. “从35S启动子往下算的第一个碱基到我的ATG起始密码子这一段是不是必须是3的倍数？”
应该是3的倍数
2.“由于NcoI本身存在一个ATG，我应该怎么设计引物才会编码出正确的蛋白呢？”

我觉得应该注意rbcs的导肽片段大小也应该与Spe I(A|CTAGT)酶切后的片段组成3的倍数，即一定要注意最后的序列选择。
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3楼2011-03-02 21:37:17
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lxjwishes

银虫 (正式写手)
AmaspNocI+: CAT CCATGG ATGGCAAAGCGCATAGCCTC 66/58℃
研究一下这个引物 也是紧紧挨着阅读框设计的
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5楼2011-03-02 22:16:12
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