版块导航: 正在加载中...

登录注册

应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜

>论坛更新日志 (3874)
>虫友互识 (659)
>文献求助 (226)
>休闲灌水 (221)
>导师招生 (213)
>考博 (131)
>论文投稿 (128)
>博后之家 (92)
>硕博家园 (87)
>招聘信息布告栏 (72)
>论文道贺祈福 (69)
>基金申请 (61)
>教师之家 (50)
>考研 (49)
>找工作 (46)
>公派出国 (24)

返回列表

lxjwishes

银虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 479.3
帖子: 314
在线: 52.9小时
虫号: 646075

[交流] 【求助/交流】求构载体高手赐教构建亚细胞定位载体pCAMBIA1302

最近要做一个亚细胞定位实验
载体信息如下：
用于植物转基因的双元转化载体.
主要用途，以gfp为基础的分子定位
检测rbcs的导肽对蛋白定位的作用
插入使用说明：
gfp:的阅读框在酶切位点上的分布如下：
NcoI-----BglII----- SpeI
CC ATG GtA GAT CTg ACT AGT aaa gga gaa ga
---M---V---D---L---T-- S-- K-- G-- E-- X

由于我的基因ORF内部有bgl II位点所以只能选择Nco I 和SpeI
但是我的基因阅读框起始密码子位置是这样的 CCATGGG ，加粗部分是我的起始密码子，本身构成了一个NcoI位点，所以我在设计引物的时候就把CC换成了其他碱基如AT。
但是我现在有一个问题没有弄清楚，就是从35S启动子往下算的第一个碱基到我的ATG起始密码子这一段是不是必须是3的倍数，由于NcoI本身存在一个ATG，我应该怎么设计引物才会编码出正确的蛋白呢？

我今天设计了一条引物
正向的：图三，我现在就是不知道这个起始密码子到35S启动子末这段是怎么算的。

分子生物学没学到家，哎！

[ Last edited by lxjwishes on 2011-3-2 at 20:48 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

急，帮看看细胞色素脱氢酶活性测定结果已经有5人回复
如何确定有机胺的溴酸盐已经全部转化为有机胺了？请高手赐教！已经有5人回复
如何定位酶与底物的作用位点已经有6人回复
293TP细胞已经有9人回复
求友情赠送白血病细胞株，叩谢啦已经有7人回复
细胞培养中的问题已经有11人回复
大肠杆菌感受态细胞的制备已经有10人回复
关于构建细胞实验室的细节问题已经有35人回复
流式细胞仪技术已经有10人回复
中科院上海生化细胞所徐国良组招聘助理研究员已经有181人回复
中科院上海生化细胞所徐国良研究组招聘博士后研究人员已经有51人回复
为什么用胰蛋白酶消化细胞？已经有6人回复
丝状真菌菌丝体破碎细胞壁，不要胞内酶，求助最简单的实验方法。。。已经有18人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2011-03-02 20:47:07

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

changes

木虫 (正式写手)

MolEPI: 3
应助: 5 (幼儿园)
金币: 3131.9
帖子: 390
在线: 250小时
虫号: 142029

lxjwishes(金币+1): 不替换gfp，是融合表达！ 2011-03-02 21:20:03

怎么做rbcs的导肽对蛋白定位的作用啊?
是要替换GFP序列吗？还是插入一部分。不明白。等高手出现。

赞一下

回复此楼

2楼2011-03-02 21:15:16

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

changes

木虫 (正式写手)

MolEPI: 3
应助: 5 (幼儿园)
金币: 3131.9
帖子: 390
在线: 250小时
虫号: 142029

引用回帖:

Originally posted by lxjwishes at 2011-03-02 20:47:07:
最近要做一个亚细胞定位实验
载体信息如下：
用于植物转基因的双元转化载体.
主要用途，以gfp为基础的分子定位
检测rbcs的导肽对蛋白定位的作用
插入使用说明：
gfp:的阅读框在酶切位点上的分布如下：
Nco ...

1. “从35S启动子往下算的第一个碱基到我的ATG起始密码子这一段是不是必须是3的倍数？”
应该是3的倍数
2.“由于NcoI本身存在一个ATG，我应该怎么设计引物才会编码出正确的蛋白呢？”

我觉得应该注意rbcs的导肽片段大小也应该与Spe I(A|CTAGT)酶切后的片段组成3的倍数，即一定要注意最后的序列选择。

赞一下

回复此楼

3楼2011-03-02 21:37:17

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

lxjwishes

银虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 479.3
帖子: 314
在线: 52.9小时
虫号: 646075

载体使用信息:---------------------------------------------------------------------------

用于植物转基因的双元转化载体.
筛选标记:潮霉素
主要用途，以gfp为基础的分子定位
检测rbcs的导肽对蛋白定位的作用
插入使用说明：
gfp:的阅读框在酶切位点上的分布如下：
NcoI-----BglII----- SpeI
CC ATG GtA GAT CTg ACT AGT aaa gga gaa ga
---M---V---D---L---T-- S-- K-- G-- E-- X
sp：Ama signal序列：
1 MAKRIASMSS LLLIALLCLS SHLAQAQVL
-->
GFP的蛋白序列：
-->
1 DLTSKGEELF TGVVPILVEL DGDVNGHKFS VSGEGEGDAT YGKLTLKFIC
51 TTGKLPVPWP TLVTTFSYGV QCFSRYPDHM KRHDFFKSAM PEGYVQERTI
101 FFKDDGNYKT RAEVKFEGDT LVNRIELKGI DFKEDGNILG HKLEYNYNSH
151 NVYIMADKQK NGIKANFKTR HNIEDGGVQL ADHYQQNTPI GDGPVLLPDN
201 HYLSTQSALS KDPNEKRDHM VLLEFVTAAG ITHGMDELYK ASHHHHX
-->
sp_gfp序列：
构建方案采取NcoI 和 SpeI连接结果正确。
-->
1 MAKRIASMSS LLLIALLCLS SHLAQAQVLT SKGEELFTGV VPILVELDGD
51 VNGHKFSVSG EGEGDATYGK LTLKFICTTG KLPVPWPTLV TTFSYGVQCF
101 SRYPDHMKRH DFFKSAMPEG YVQERTIFFK DDGNYKTRAE VKFEGDTLVN
151 RIELKGIDFK EDGNILGHKL EYNYNSHNVY IMADKQKNGI KANFKTRHNI
201 EDGGVQLADH YQQNTPIGDG PVLLPDNHYL STQSALSKDP NEKRDHMVLL
251 EFVTAAGITH GMDELYKASH HHHX
-->
载体设计：
AmaspNocI+: CAT CCATGG ATGGCAAAGCGCATAGCCTC 66/58℃
AmaspSpeI-: CTC ACTAGT GAGGACCTGGGCTTGGGC 66/60℃
-----------------------------------------------------------------------------------------------
附：O.sativa alpha-amylase (alpha-Amy3) gene
LOCUS RICAMYA 1317 bp DNA linear PLN 27-APR-1993
DEFINITION O.sativa alpha-amylase (alpha-Amy3) gene, complete cds.
ACCESSION M24941
VERSION M24941.1 GI:169774
KEYWORDS alpha-amylase; alpha-amylase 3.
SOURCE Oryza sativa (rice)
ORGANISM Oryza sativa
Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta;
Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Poales; Poaceae; BEP
clade; Ehrhartoideae; Oryzeae; Oryza.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1317)
AUTHORS Sutliff,T.D., Huang,N. and Rodriguez,R.L.
TITLE Isolation and characterization of a rice alpha-amylase multigene
locus
JOURNAL Unpublished (1989)
COMMENT Original source text: O.stativa (strain cv. M202; EMBL4 library)
leaf DNA.
Draft entry and computer-readable sequence for [1] kindly submitted
by T.D.Sutliff, 26-MAY-1989.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1317
/organism="Oryza sativa"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:4530"
CDS 1..1317
/note="alpha-amylase precursor (EC 3.2.1.1)"
/codon_start=1
/protein_id="AAA33897.1"
/db_xref="GI:169775"
/translation="MAKRIASMSSLLLIALLCLSSHLAQAQVLFQGFNWESWKKQGGW
YNFLHGHVDDIAATGVTHVWLPPPSHSVAPQGYMPGRLYDLDASKYGTGAELRSLIAA
FHSKGIKCVADIVINHRCADYKDSRGIYCIFEGGTPDSRLDWGPDMICSDDTQYSNGR
GHRDTGADFGAAPDIDHLNTRVQTELSDWLNWLKSDVGFDGWRLDFAKGYSAAVAKTY
VDNTDPSFVVAEIWSNMRYDGNGEPSWNQDGDRQELVNWAQAVGGPASAFDFTTKGEL
QAAVQGELWRMKDGNGKAPGMIGWLPEKAVTFIDNHDTGSTQNSWPFPSDKVMQGYAY
ILTHPGVPCIFYDHVFDWNLKQEISTLAAVRSRNEIHPGSKLKILAAEGDVYVAMIDD
KVITKIGTRYDVGNLIPSDFHVVAHGNNYCIWEKSGLRVPAGRHHY"
sig_peptide 1..78
/note="alpha-amylase signal peptide"
mat_peptide 76..1314
/product="alpha-amylase"
ORIGIN Unreported.
1 atggcaaagc gcatagcctc aatgagcagc ctcctcctta tcgccttgct ctgtctgagc
61 tctcacttgg cccaagccca ggtcctcttc caggggttca actgggagtc gtggaagaag
121 cagggcgggt ggtacaactt cctccatggc cacgtcgacg acatcgccgc gaccggtgtc
181 acgcacgtct ggctcccacc gccgtcgcac tccgtcgccc cgcagggata catgccgggc
241 cggctctacg acctggacgc ttccaagtac ggcacggggg cagagctcag gtcgctgatc
301 gccgccttcc acagcaaagg catcaagtgc gtcgccgaca tcgtcatcaa ccaccggtgc
361 gcggattaca aggatagccg tggcatctac tgcattttcg agggtggcac gccggacagc
421 cgcctcgact ggggccccga catgatctgc agcgacgaca cgcagtactc caacggccgc
481 ggtcaccgcg acaccggcgc agacttcggc gcggcgcccg acatcgacca cctcaacacg
541 cgtgtgcaga cagagctgtc cgactggctc aattggctca agtccgacgt cggcttcgac
601 ggctggcgcc tcgacttcgc caagggatac tcggcggccg tcgccaagac gtacgtcgac
661 aacaccgacc cgtccttcgt cgtcgccgag atatggagca acatgcgtta cgacggcaac
721 ggtgagccgt cgtggaacca ggacggtgac cggcaggagc tggtgaactg ggcgcaggcc
781 gtcggtggcc ctgcgtcagc gttcgacttc acgaccaagg gcgagctgca ggcggcggtg
841 caaggtgagc tgtggcggat gaaggacggc aacggcaagg cgccggggat gattggctgg
901 ctgccagaga aggccgtcac cttcatcgac aaccatgaca ctggctccac acagaactca
961 tggccgttcc cctccgacaa ggtcatgcag ggctacgcct acatcctcac acaccctgga
1021 gtaccctgca ttttctacga ccatgtattt gactggaacc tgaagcagga gatcagcaca
1081 ttagctgcag tgagatcaag aaatgagatt catcccggga gcaagctgaa aatccttgct
1141 gctgagggag acgtctatgt cgccatgatc gatgataagg tcataacaaa gattgggaca
1201 cggtatgacg tgggcaactt aatcccgtca gacttccatg tcgttgctca cggcaacaat
1261 tactgcattt gggaaaagag cggtctcaga gttcctgcag ggcggcacca ctattag
//

赞一下

回复此楼

4楼2011-03-02 22:15:26

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖