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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】表达载体构建不成功的原因
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王雨云

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】表达载体构建不成功的原因 已有15人参与

目前在构建一个表达载体，经同样双酶切的目的基因和PPICZA已经获得，且表达载体是从以前构建好的载体中酶切下来的，所以不存在没切开的问题。现在将目的基因跟PPICZA连接，用了T4 连接酶和Solution1分别连接过，都能长菌，但没有要的阳性克隆，每次转化后摇24小时才能长出来，且可以长很多菌，但单菌落很小。感受态是没有问题的，实在不知道问题出在哪里，已经重复很多次了，都得不到成功的转化子。（以前成功将该目的基因与PPICZA连接过，但目的基因未去除信号肽）望大家来分享一下你们的宝贵经验！
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1楼 2010-06-08 20:38:15
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-06-08 23:01:28
把你用的表达载体（不要做酶切，就是以前的那个）转一下感受态细胞，看生长情况怎么样，是不是也要经过24h才能长出菌落。如果能够正常生长再考虑别的原因,比如酶切体系和连接反应时否有问题
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2010-06-08 20:48:18
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你用的表达载体是Z抗的，超过24h抗性就失效了，所以24h后长出的菌落很可能是杂斑，看一下你的抗性是不是用错了。
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2010-06-08 20:54:54
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王雨云

金虫 (小有名气)
没有用错，是在24小时内长出来了，长到24小时后才可以转板，前面菌落都太小了。
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4楼2010-06-08 21:02:40
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2010-06-08 20:48:18:
把你用的表达载体（不要做酶切，就是以前的那个）转一下感受态细胞，看生长情况怎么样，是不是也要经过24h才能长出菌落。如果能够正常生长再考虑别的原因,比如酶切体系和连接反应时否有问题

以前不会长到24小时，大概就14小时左右就长大了，酶切体系和连接反应都检查好多遍，没什么问题，因为以前都这样就长出来，现在已经重复了很多遍了，实在不知道哪里有问题，不知道连接温度对连接效率有多大的影响，我是16°过夜连接的
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5楼2010-06-08 21:05:34
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
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scelab(金币+1):有道理~~~ 2010-06-08 23:01:46
个人认为主要还是目的基因跟PPICZA连接不够。
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6楼2010-06-08 21:36:58
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375050424

银虫 (小有名气)
不知道你的片段多大，可能你的连接时间不够
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7楼2010-06-08 22:54:32
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dfl204 at 2010-06-08 21:36:58:
个人认为主要还是目的基因跟PPICZA连接不够。

可能是吧，决定改变连接体系，希望能得到好的结果
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8楼2010-06-09 08:42:54
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 375050424 at 2010-06-08 22:54:32:
不知道你的片段多大，可能你的连接时间不够

片段是1200bp，以前没有除去信号肽的时候就已经成功连接上了，现在去除了信号肽，酶切位点也是一样的，同样的连接体系就是连不上了，现在就只能继续改变连接体系了，实验室有人也是这样做并取得成功了。希望我也有那么好的运气。
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9楼2010-06-09 08:47:13
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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你的载体是由双酶切切开的重组质粒，如果回收干净的话，个人觉得如果没有连好目的基因是不可能长菌的，竟然长了很多且没有你要的阳性，说明你的载体很可能没有切干净，也没有回收干净。
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Thank-you，so-blue.
10楼2010-06-09 10:25:09
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