应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】表达载体构建不成功的原因
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
281/3返回列表123下一页
查看: 4566  |  回复: 27
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

王雨云

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】表达载体构建不成功的原因 已有15人参与

目前在构建一个表达载体，经同样双酶切的目的基因和PPICZA已经获得，且表达载体是从以前构建好的载体中酶切下来的，所以不存在没切开的问题。现在将目的基因跟PPICZA连接，用了T4 连接酶和Solution1分别连接过，都能长菌，但没有要的阳性克隆，每次转化后摇24小时才能长出来，且可以长很多菌，但单菌落很小。感受态是没有问题的，实在不知道问题出在哪里，已经重复很多次了，都得不到成功的转化子。（以前成功将该目的基因与PPICZA连接过，但目的基因未去除信号肽）望大家来分享一下你们的宝贵经验！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-06-08 20:38:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-06-08 23:01:28
把你用的表达载体（不要做酶切，就是以前的那个）转一下感受态细胞，看生长情况怎么样，是不是也要经过24h才能长出菌落。如果能够正常生长再考虑别的原因,比如酶切体系和连接反应时否有问题
赞一下(2人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2010-06-08 20:48:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你用的表达载体是Z抗的，超过24h抗性就失效了，所以24h后长出的菌落很可能是杂斑，看一下你的抗性是不是用错了。
赞一下(1人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2010-06-08 20:54:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王雨云

金虫 (小有名气)
没有用错，是在24小时内长出来了，长到24小时后才可以转板，前面菌落都太小了。
赞一下 回复此楼
4楼2010-06-08 21:02:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2010-06-08 20:48:18:
把你用的表达载体（不要做酶切，就是以前的那个）转一下感受态细胞，看生长情况怎么样，是不是也要经过24h才能长出菌落。如果能够正常生长再考虑别的原因,比如酶切体系和连接反应时否有问题

以前不会长到24小时，大概就14小时左右就长大了，酶切体系和连接反应都检查好多遍，没什么问题，因为以前都这样就长出来，现在已经重复了很多遍了，实在不知道哪里有问题，不知道连接温度对连接效率有多大的影响，我是16°过夜连接的
赞一下 回复此楼
5楼2010-06-08 21:05:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):有道理~~~ 2010-06-08 23:01:46
个人认为主要还是目的基因跟PPICZA连接不够。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2010-06-08 21:36:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

375050424

银虫 (小有名气)
不知道你的片段多大，可能你的连接时间不够
赞一下 回复此楼
7楼2010-06-08 22:54:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dfl204 at 2010-06-08 21:36:58:
个人认为主要还是目的基因跟PPICZA连接不够。

可能是吧，决定改变连接体系，希望能得到好的结果
赞一下 回复此楼
8楼2010-06-09 08:42:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 375050424 at 2010-06-08 22:54:32:
不知道你的片段多大，可能你的连接时间不够

片段是1200bp，以前没有除去信号肽的时候就已经成功连接上了，现在去除了信号肽，酶切位点也是一样的，同样的连接体系就是连不上了，现在就只能继续改变连接体系了，实验室有人也是这样做并取得成功了。希望我也有那么好的运气。
赞一下 回复此楼
9楼2010-06-09 08:47:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的载体是由双酶切切开的重组质粒，如果回收干净的话，个人觉得如果没有连好目的基因是不可能长菌的，竟然长了很多且没有你要的阳性，说明你的载体很可能没有切干净，也没有回收干净。
赞一下(1人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
10楼2010-06-09 10:25:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 王雨云 的主题更新
281/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0703化学 +14 妮妮ninicgb 2026-03-27 14/700 2026-03-30 12:46 by fangnagu
[有机交流] 考研调剂 +5 watb 2026-03-26 5/250 2026-03-30 11:51 by yjolah
[考研] 297求调剂 +13 田洪有 2026-03-26 13/650 2026-03-30 11:33 by 替代品000
[考研] 一志愿北京工业大学，324分求调剂 +6 零八# 2026-03-28 6/300 2026-03-29 21:20 by nanaliuyun
[考研] 环境工程 085701，267求调剂 +6 minht 2026-03-29 6/300 2026-03-29 16:21 by 学员8dgXkO
[考研] 086000生物与医药调剂 +5 Feisty。 2026-03-28 9/450 2026-03-29 12:02 by longlotian
[考研] 本科双非材料，跨考一志愿华电085801电气，283求调剂，任何专业都可以 +6 芝士雪baoo 2026-03-28 8/400 2026-03-29 08:16 by 松花缸1201
[考研] 一志愿华理，数一英一285求A区调剂 +8 AZMK 2026-03-25 12/600 2026-03-28 18:15 by AZMK
[考研] 283求调剂 +3 A child 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:41 by ms629
[考研] 322求调剂 +5 旧吢 2026-03-24 5/250 2026-03-28 13:26 by Iveryant
[考研] 266分，求材料冶金能源化工等调剂 +7 哇呼哼呼哼 2026-03-27 9/450 2026-03-28 12:22 by zllcz
[考研] 286求调剂 +12 PolarBear11 2026-03-26 12/600 2026-03-28 12:14 by zllcz
[考研] 070300化学求调剂 +4 起个名咋这么难 2026-03-27 4/200 2026-03-27 21:39 by 83503孙老师
[考博] 26申博 +3 加油冲啊！ 2026-03-26 3/150 2026-03-27 15:38 by cls512
[考研] 274求调剂 +17 顾九笙要谦虚 2026-03-24 23/1150 2026-03-27 15:16 by caszguilin
[考研] 化学调剂一志愿上海交通大学336分-本科上海211 +4 小鱼爱有机 2026-03-25 4/200 2026-03-26 10:19 by aa331100
[考研] 334分 一志愿武理-080500 材料求调剂 +4 李李不服输 2026-03-25 4/200 2026-03-25 21:26 by 星空星月
[考研] 296求调剂 +4 汪！？！ 2026-03-25 7/350 2026-03-25 16:41 by 汪！？！
[考研] 293求调剂 +7 加一一九 2026-03-24 7/350 2026-03-25 12:02 by userper
[考研] 生物学学硕求调剂 +7 小羊睡着了? 2026-03-23 10/500 2026-03-25 02:24 by 清风拂扬。 m
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭