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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】表达载体构建不成功的原因
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王雨云

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】表达载体构建不成功的原因 已有15人参与

目前在构建一个表达载体，经同样双酶切的目的基因和PPICZA已经获得，且表达载体是从以前构建好的载体中酶切下来的，所以不存在没切开的问题。现在将目的基因跟PPICZA连接，用了T4 连接酶和Solution1分别连接过，都能长菌，但没有要的阳性克隆，每次转化后摇24小时才能长出来，且可以长很多菌，但单菌落很小。感受态是没有问题的，实在不知道问题出在哪里，已经重复很多次了，都得不到成功的转化子。（以前成功将该目的基因与PPICZA连接过，但目的基因未去除信号肽）望大家来分享一下你们的宝贵经验！
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1楼 2010-06-08 20:38:15
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王雨云

金虫 (小有名气)
没有用错，是在24小时内长出来了，长到24小时后才可以转板，前面菌落都太小了。
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4楼2010-06-08 21:02:40
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2010-06-08 20:48:18:
把你用的表达载体（不要做酶切，就是以前的那个）转一下感受态细胞，看生长情况怎么样，是不是也要经过24h才能长出菌落。如果能够正常生长再考虑别的原因,比如酶切体系和连接反应时否有问题

以前不会长到24小时，大概就14小时左右就长大了，酶切体系和连接反应都检查好多遍，没什么问题，因为以前都这样就长出来，现在已经重复了很多遍了，实在不知道哪里有问题，不知道连接温度对连接效率有多大的影响，我是16°过夜连接的
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5楼2010-06-08 21:05:34
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dfl204 at 2010-06-08 21:36:58:
个人认为主要还是目的基因跟PPICZA连接不够。

可能是吧，决定改变连接体系，希望能得到好的结果
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8楼2010-06-09 08:42:54
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王雨云

金虫 (小有名气)
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Originally posted by 375050424 at 2010-06-08 22:54:32:
不知道你的片段多大，可能你的连接时间不够

片段是1200bp，以前没有除去信号肽的时候就已经成功连接上了，现在去除了信号肽，酶切位点也是一样的，同样的连接体系就是连不上了，现在就只能继续改变连接体系了，实验室有人也是这样做并取得成功了。希望我也有那么好的运气。
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9楼2010-06-09 08:47:13
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-06-09 11:43:36:
连接没酶换一下，用宝生物的solutionI不错～

都用过了，还是不行
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16楼2010-06-10 09:46:03
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王雨云

金虫 (小有名气)
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Originally posted by liyong1981 at 2010-06-10 12:50:30:
一切的一切都重新来过好了～

已经重新来过好几遍了，哎，运气真的不好呀
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18楼2010-06-10 15:25:08
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-06-10 16:32:40:
换个地方坐坐，或者让别人给你做～

呵呵，我们也这样安慰别人！
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20楼2010-06-11 16:53:40
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王雨云

金虫 (小有名气)
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楼: Originally posted by 构建载体 at 2012-02-13 09:36:12:
我现在也是遇到了同样的问题，双酶切之后连接已经好几个月了，一直不成功，几乎是所有的可能因素都考虑到了，就是做不出来，都快疯了，希望我们可以探讨互相交流下

重新扩基因，重新连接吧，实在不行，重新设计酶切位点，从头做起，我也忘记了我怎么做出来的了。已经毕业了，选择性忘记以前那些不好的记忆了，哈哈哈！祝你好运哈！
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23楼2012-02-13 10:59:01
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