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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 已知全长基因怎样克隆并构建表达载体
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zqt123_1981

木虫 (小有名气)

[求助] 已知全长基因怎样克隆并构建表达载体

目的基因在Genbank有mRNA全长序列，我想把它克隆出来构建表达载体，1 atggctgtag cggaggaact gagaaacgct ccacgtgcaa agggtccggc caccatccta。。。。。。
1141 actgttgtgc tgcatagcat tcctacaatt acaaattaa。请问怎样设计引物克隆全长？？pGM-T载体的话还用添加酶切位点与保护碱基吗？有同仁说直接从头尾各选一定长度的碱基就可以吗？怎样验证啊
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1楼 2011-07-07 16:15:33
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

zqt123_1981(金币+1): 2011-07-13 16:38:26
用oligo设计软件，你要想真的扩增它的全长的话确实是取头和尾的一定碱基，酶切位点和保护碱基肯定是要的，你不妨先学学oligo软件，或者是DNAman也是可以的，不过前者更好一些，还有就是学学引物设计原则。
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2楼2011-07-07 20:49:10
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

zqt123_1981(金币+1): 2011-07-13 16:38:21
本来还想着给你一篇关于PCR引物设计及软件使用技巧的，怎么没看到上传的字样呢？？？
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3楼2011-07-07 20:51:26
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

zqt123_1981(金币+1): 2011-07-13 16:38:15
1 引物可以直接取头尾，因为已经是一个完整的CDS了。
2 你先做克隆的话，如果T载上的酶切位点可用，就不需要添加酶切位点和保护碱基了。
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Thank-you，so-blue.
4楼2011-07-08 08:43:07
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zqt123_1981

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yesucao at 2011-07-07 20:49:10:
用oligo设计软件，你要想真的扩增它的全长的话确实是取头和尾的一定碱基，酶切位点和保护碱基肯定是要的，你不妨先学学oligo软件，或者是DNAman也是可以的，不过前者更好一些，还有就是学学引物设计原则。

oligo与DNAMAN我会用点，但不精，我想知道取头和尾一定碱基的话怎么用软件分析这对引物啊 我看了一下上下游的GC含量差的很大，上游在66%，而下游只有36%，可以吗？
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5楼2011-07-08 08:46:46
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

zqt123_1981(金币+1): 2011-07-13 16:38:09
楼主可以多设计几条加上酶切位点的引物！
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jiayoubashaonian
6楼2011-07-08 10:05:18
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

zqt123_1981(金币+1): 2011-07-13 16:38:03
引用回帖:
Originally posted by zqt123_1981 at 2011-07-08 08:46:46:
oligo与DNAMAN我会用点，但不精，我想知道取头和尾一定碱基的话怎么用软件分析这对引物啊 我看了一下上下游的GC含量差的很大，上游在66%，而下游只有36%，可以吗？

takara公司有专门针对高gc含量的GC buffer。对应有LA-Taq酶，可以直接接入T载体的。

验证的话，先酶切，条带大小正确的话，送去测序
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7楼2011-07-08 10:54:53
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

zqt123_1981(金币+1): 2011-07-13 16:37:57
应该有专门的试剂盒，可以帮助你加到载体上，以前在文献里有看到过。
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8楼2011-07-08 11:23:38
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

zqt123_1981(金币+1): 2011-07-13 16:37:49
将片段两边用Klenow片段补平，然后进行片段末端的磷酸化。同时选择要用的载体，进行酶切成线性，去磷酸化，与你的片段平末端连接，导入感受态，用你的载体的抗性选择，得到的菌就应该是你要的载体与片段的连接产物。不知道这个方法对你有没有帮助。
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9楼2011-07-09 17:44:20
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