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zqt123_1981

木虫 (小有名气)

[交流] 已知基因全长,克隆构建表达载体 已有5人参与

目的基因在Genbank有mRNA全长序列,我想把它克隆出来构建表达载体,1 atggctgtag cggaggaact gagaaacgct ccacgtgcaa agggtccggc caccatccta。。。。。。
1141 actgttgtgc tgcatagcat tcctacaatt acaaattaa。请问怎样设计引物克隆全长??pGM-T载体的话还用添加酶切位点与保护碱基吗?有同仁说直接从头尾各选一定长度的碱基就可以吗?怎样验证啊

[ Last edited by zqt123_1981 on 2011-7-7 at 11:22 ]
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zhenzhen2050

铜虫 (初入文坛)

TA克隆
2楼2011-06-30 14:53:55
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豆豆鱼

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-06-30 21:06:53
克隆基因就用cDNA做模板,分析起始和终止位点,设计一对上下游引物就可以PCR了。
3楼2011-06-30 17:46:15
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cona

银虫 (职业作家)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
看扩中间好扩的片段,再做walking。
4楼2011-06-30 20:25:36
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gwbk

木虫 (正式写手)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
看样子楼主做的是真核细胞基因克隆
首先找到这个mRNA所属的种属,具体到某一株,或者某一类型的细胞。
提取组织或细胞中的总mRNA为模板,根据已知序列mRNA设计引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增。

如果是原核细胞,什么都免了,直接根据mRNA设计引物,提取该mRNA菌株的基因组做模板,pcr。

可以简单把mRNA当做DNA基因的正义链来设计引物。
5楼2011-06-30 21:17:06
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lousulin

金虫 (小有名气)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
设计引物很简单的,有相关软件,不用软件自己看着序列设也可以,注意Tm值,引入酶切位点,最好加上几个保护碱基。长度20几个bp就OK啦。
6楼2011-07-01 00:36:16
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