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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 克隆基因全长引物设计问题
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llzhang2012

[交流] 克隆基因全长引物设计问题已有9人参与

已知一序列全长，如何根据此序列设计引物克隆出全长，我是新手，麻烦各位详细介绍一下设计全长引物的步骤，最近实验急需，非常感谢！！！
  我以前克隆过片段，没有做过全长，引物设计的一些基本原则都已了解，但是设计全长引物一点都不懂，劳烦各位，谢谢！
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1楼2009-11-04 14:59:57
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sd3824289

木虫 (正式写手)
引物设计应注意如下要点：  
1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。  

2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。  

3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。  

4 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。  

5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。  

6  ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。  

7 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。  

8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
    另外本人建议楼主在论坛里搜索一下primer 5.0软件！很好用的！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
27楼2012-07-25 16:36:12
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
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引用回帖:
Originally posted by llzhang2012 at 2009-11-5 15:33:

不到2kb

1、从你的全长基因的正义链直接数出16-20个碱基（从ATG开始），然后在它的5‘端加上游酶切位点，如果需要的话加上保护碱基。
2、从你的全长基因的反义链从5’-3‘端直接数出16-20个碱基，后在它的5‘端加上游酶切位点，如果需要的话加上保护碱基。
这样引物就设计好了。
注意：上下游的酶切位点不要设计反了。
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7楼2009-11-06 00:09:19
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xiangao

金虫 (正式写手)
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从ATG开始设计上游引物   TAA处设计下游引物
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3楼2009-11-04 16:22:43
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llzhang2012

引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-6 00:09:

1、从你的全长基因的正义链直接数出16-20个碱基（从ATG开始），然后在它的5‘端加上游酶切位点，如果需要的话加上保护碱基。
2、从你的全长基因的反义链从5’-3‘端直接数出16-20个碱基，后在它的5‘端加上游酶 ...

谢谢你的帮助，我现在设计了一对引物，上游引物是从序列第一次出现ATG的地方开始数出20个碱基，下游引物是从序列尾部ATT的地方向前数出20个碱基，我没有加酶切位点和保护碱基，因为刚接触分子生物学不久，学的东西也少，不知道怎样加，这样可以吗？
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9楼2009-11-06 10:17:41
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
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amisking(金币+2,VIP+0): 11-6 16:54
引用回帖:
Originally posted by llzhang2012 at 2009-11-6 10:17:

谢谢你的帮助，我现在设计了一对引物，上游引物是从序列第一次出现ATG的地方开始数出20个碱基，下游引物是从序列尾部ATT的地方向前数出20个碱基，我没有加酶切位点和保护碱基，因为刚接触分子生物学不久，学的东 ...

如果你只是想P出各个基因的话，这样设计就可以了。但是你P出这个基因后肯定是要研究它的功能，对它进行表达或者其他的吧。所以后面你肯定是要连到相应的载体上，对吧？如果你不设计酶切位点的话，要与目的载体连接的话就需要用平端连接，那样假阳性率会很高，并且需要判断你插入的序列的方向，因此最好还是加上与你的目的载体上相应的酶切位点。
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10楼2009-11-06 16:14:26
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普通回帖

陈思容

铜虫 (正式写手)
序列大小？
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2楼2009-11-04 15:39:09
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小白3521

金虫 (小有名气)
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引物上要加酶切位点和保护碱基
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4楼2009-11-04 17:02:39
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llzhang2012

引用回帖:
Originally posted by 小白3521 at 2009-11-4 17:02:
引物上要加酶切位点和保护碱基

具体要怎样加啊？
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5楼2009-11-05 15:31:25
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llzhang2012

引用回帖:
Originally posted by llzhang2012 at 2009-11-4 14:59:
已知一序列全长，如何根据此序列设计引物克隆出全长，我是新手，麻烦各位详细介绍一下设计全长引物的步骤，最近实验急需，非常感谢！！！
  我以前克隆过片段，没有做过全长，引物设计的一些基本原则都已了解，但 ...

不到2kb
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6楼2009-11-05 15:33:03
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

视情况而定

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amisking(金币+2,VIP+0): 11-6 08:18
要是基因不长，在一千到两千bp那就设计一个引物，要是很长就分段设计，逐步克隆，引物长度一般在12-25bp。有专门的引物设计软件，很好用的，你都知道全场了，想必是什么都知道了，那就对照着做好了，挑选一段特异性好的设计引物，成功的概率大。祝好！
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8楼2009-11-06 07:32:55
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