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llzhang2012

[交流] 克隆基因全长引物设计问题已有9人参与

已知一序列全长,如何根据此序列设计引物克隆出全长,我是新手,麻烦各位详细介绍一下设计全长引物的步骤,最近实验急需,非常感谢!!!
  我以前克隆过片段,没有做过全长,引物设计的一些基本原则都已了解,但是设计全长引物一点都不懂,劳烦各位,谢谢!
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sd3824289

木虫 (正式写手)

引物设计应注意如下要点:  
1 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。  

2 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加[2]。  

3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。  

4 引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。  

5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。  

6  ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。  

7 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。  

8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
    另外本人建议楼主在论坛里搜索一下primer 5.0软件!很好用的!
坚持,就像流星,即使知道最后的结果,也要勇敢的走到最后!
27楼2012-07-25 16:36:12
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

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Originally posted by llzhang2012 at 2009-11-5 15:33:

不到2kb

1、从你的全长基因的正义链直接数出16-20个碱基(从ATG开始),然后在它的5‘端加上游酶切位点,如果需要的话加上保护碱基。
2、从你的全长基因的反义链从5’-3‘端直接数出16-20个碱基,后在它的5‘端加上游酶切位点,如果需要的话加上保护碱基。
这样引物就设计好了。
注意:上下游的酶切位点不要设计反了。
7楼2009-11-06 00:09:19
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xiangao

金虫 (正式写手)


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从ATG开始设计上游引物   TAA处设计下游引物
3楼2009-11-04 16:22:43
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llzhang2012

引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-6 00:09:

1、从你的全长基因的正义链直接数出16-20个碱基(从ATG开始),然后在它的5‘端加上游酶切位点,如果需要的话加上保护碱基。
2、从你的全长基因的反义链从5’-3‘端直接数出16-20个碱基,后在它的5‘端加上游酶 ...

谢谢你的帮助,我现在设计了一对引物,上游引物是从序列第一次出现ATG的地方开始数出20个碱基,下游引物是从序列尾部ATT的地方向前数出20个碱基,我没有加酶切位点和保护碱基,因为刚接触分子生物学不久,学的东西也少,不知道怎样加,这样可以吗?
9楼2009-11-06 10:17:41
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

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amisking(金币+2,VIP+0): 11-6 16:54
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Originally posted by llzhang2012 at 2009-11-6 10:17:

谢谢你的帮助,我现在设计了一对引物,上游引物是从序列第一次出现ATG的地方开始数出20个碱基,下游引物是从序列尾部ATT的地方向前数出20个碱基,我没有加酶切位点和保护碱基,因为刚接触分子生物学不久,学的东 ...

如果你只是想P出各个基因的话,这样设计就可以了。但是你P出这个基因后肯定是要研究它的功能,对它进行表达或者其他的吧。所以后面你肯定是要连到相应的载体上,对吧?如果你不设计酶切位点的话,要与目的载体连接的话就需要用平端连接,那样假阳性率会很高,并且需要判断你插入的序列的方向,因此最好还是加上与你的目的载体上相应的酶切位点。
10楼2009-11-06 16:14:26
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陈思容

铜虫 (正式写手)

序列大小?
2楼2009-11-04 15:39:09
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小白3521

金虫 (小有名气)


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引物上要加酶切位点和保护碱基
4楼2009-11-04 17:02:39
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llzhang2012

引用回帖:
Originally posted by 小白3521 at 2009-11-4 17:02:
引物上要加酶切位点和保护碱基

具体要怎样加啊?
5楼2009-11-05 15:31:25
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llzhang2012

引用回帖:
Originally posted by llzhang2012 at 2009-11-4 14:59:
已知一序列全长,如何根据此序列设计引物克隆出全长,我是新手,麻烦各位详细介绍一下设计全长引物的步骤,最近实验急需,非常感谢!!!
  我以前克隆过片段,没有做过全长,引物设计的一些基本原则都已了解,但 ...

不到2kb
6楼2009-11-05 15:33:03
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

视情况而定

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要是基因不长,在一千到两千bp那就设计一个引物,要是很长就分段设计,逐步克隆,引物长度一般在12-25bp。有专门的引物设计软件,很好用的,你都知道全场了,想必是什么都知道了,那就对照着做好了,挑选一段特异性好的设计引物,成功的概率大。祝好!
8楼2009-11-06 07:32:55
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