| 查看: 2158 | 回复: 7 | |||
[交流]
【求助/交流】基因克隆设计引物已有7人参与
|
| 现在从NCBI上找到三条序列，引物设计的时候，匹配率80%左右，不知是不是太低。再就是设计过程要注意哪些中事项，才能保证准确性？谢谢高手指点。 |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有124人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
求助-基因克隆及引物设计的问题
已经有6人回复- 载体构建技术请教，如何设计引物提取基因插入载体中？
已经有3人回复
- 【求助/交流】基因做表达实验必须要克隆全长吗？
已经有7人回复
- 【求助/交流】加急~~~求助：关于基因克隆与表达引物设计的问题！希望高人指点！
已经有3人回复
- 【求助】求教基因克隆中的引物设计问题【有效期至2010年11月18日】
已经有6人回复
- 【求助/交流】目的基因克隆总不成功
已经有5人回复
- 【求助/交流】求助基因克隆方面的问题解决方案
已经有17人回复
- 克隆基因全长引物设计问题
已经有32人回复
2楼2010-10-15 10:31:48
王会征
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 9394.2
- 散金: 6
- 红花: 8
- 帖子: 1066
- 在线: 243.2小时
- 虫号: 470121
- 注册: 2007-11-29
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-10-15 11:50:46
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-10-15 11:50:46
|
引物设计应注意如下要点： 1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6 ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。 7 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。 8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 |
3楼2010-10-15 10:47:06
继续学习学习！4楼2010-10-15 13:28:18
taigongzaici
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 325.7
- 散金: 12
- 红花: 1
- 帖子: 157
- 在线: 19.1小时
- 虫号: 1115977
- 注册: 2010-10-07
- 专业: 水产生物遗传育种学
5楼2010-10-16 08:59:42
sd3824289
木虫 (正式写手)
- 应助: 47 (小学生)
- 金币: 2304.1
- 散金: 33
- 帖子: 740
- 在线: 105.5小时
- 虫号: 1657712
- 注册: 2012-03-02
- 专业: 生物化学
6楼2012-07-25 16:32:36
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
7楼2015-09-11 15:33:27
8楼2016-03-02 14:47:08