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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建技术请教，如何设计引物提取基因插入载体中？
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hshzhq

铜虫 (正式写手)

[交流] 载体构建技术请教，如何设计引物提取基因插入载体中？

现在的目的是：
1、从人的细胞中获取MUC1基因的序列，这一步需要说一下引物设计方面信息，有个问题，除了设计出引物P出基因的CDS序列之外，肯定是需要在这个CDS序列前后加入酶切位点的，但是本身基因没有酶切位点，这个怎么才能加上酶切位点？
2、vector的酶切酶连，酶切就是容易，但是选择的酶切类型应该要与之前P出的基因加上去两端的酶切位点一致的，是吧？
3、如果是做shRNA和microRNA研究，序列怎么添加酶切位点？
最好举个例。
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1楼 2011-12-28 15:38:49
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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小丹木木(金币+3): 鼓励新虫发帖哦，GOOD! 2012-01-09 09:44:13
看来这个问题没人回答，我就答一下吧，楼主应该是不常做分子这一块的实验吧。这个问题的解决思路是：
1、分析你想要做的基因的序列的限制性酶切图谱和你要用到的载体的多克隆位点，选取两个你基因上没有酶切位点但是载体的多克隆位点上有的酶切位点，而且这两个酶最好是常用的，可以双酶切的。
2、设计引物，将酶切位点加在你设计的上下游引物上，此时你要确定载体上多克隆位点的表达是有方向的，哪个酶切位点在前面你就把哪个酶切位点放在上游引物上，后面的放在下游引物上。你也可以在引物的酶切位点上加上保护碱基。
3、用引物pcr扩增目的基因，将其连在克隆载体上，如果引物上有保护碱基的话也可以直接将PCR产物酶切，与酶切之后的载体连接，然后转化大肠杆菌就可以了。
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2楼2012-01-08 21:56:49
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hshzhq

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-01-08 21:56:49:
看来这个问题没人回答，我就答一下吧，楼主应该是不常做分子这一块的实验吧。这个问题的解决思路是：
1、分析你想要做的基因的序列的限制性酶切图谱和你要用到的载体的多克隆位点，选取两个你基因上没有酶切位点 ...

双酶切是什么意思？需要考虑两个不同切割酶的Buffer性质和其他特性吗？“如果引物上有保护碱基的话也可以直接将PCR产物酶切，与酶切之后的载体连接”里面的意思是不是退火成双链后就可以酶切，是这个意思吗？
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3楼2012-01-09 23:11:29
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2012-01-10 17:34:11
hshzhq(金币+5): 2012-01-18 15:53:59
引用回帖:
2楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-01-08 21:56:49:
看来这个问题没人回答，我就答一下吧，楼主应该是不常做分子这一块的实验吧。这个问题的解决思路是：
1、分析你想要做的基因的序列的限制性酶切图谱和你要用到的载体的多克隆位点，选取两个你基因上没有酶切位点 ...

对啊，需要考虑要用到的两种酶的性质啊，看看是否有通用的buffer，PCR产物最好是凝胶回收或者是PCR产物回收之后，再酶切。
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4楼2012-01-10 11:48:16
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