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vs570588

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】怎样设计目的基因的引物

我自己驯化的微生物，想设计一对引物，来测定微生物合成某种特殊酶的情况。这种酶的基因可以从NCBI中查到。我打算合成这种引物来做定量PCR。我是初学者，能详细给我介绍一下过程。也看到别人设计的引物，但定量PCR下来并不是很理想。
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1楼 2011-03-09 21:04:49
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nininini

银虫 (小有名气)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2): good 2011-03-10 17:16:09
做定量PCR的话目的序列大概在80~150bp就好了~~可以根据NCBI的序列查找一下保守序列，通过RNA序列分析挑选无二级结构的区段进行设计就好了~引物25个左右的bp吧，别太短，引物的特异性挺关键的
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2楼2011-03-09 21:50:36
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wangleisdnu

金虫 (正式写手)
you should use some soft ware like clonemanager to design, to make your interested gene primers and the internal control gene primers have the similar annealing temperature
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3楼2011-03-09 21:53:23
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2): 嗯，引物设计的软件很多，可以找一个自己喜欢的 2011-03-10 17:17:08
用PrimeExpress设计,结果可以和NCBI上的primeblast检测是否特异
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4楼2011-03-10 01:19:16
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vs570588

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangleisdnu at 2011-03-09 21:53:23:
you should use some soft ware like clonemanager to design, to make your interested gene primers and the internal control gene primers have the similar annealing temperature

can you give me the example that is similar to my requirements, please?  i am looking forward your return.
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5楼2011-03-10 10:03:21
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vs570588

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-03-09 21:50:36:
做定量PCR的话目的序列大概在80~150bp就好了~~可以根据NCBI的序列查找一下保守序列，通过RNA序列分析挑选无二级结构的区段进行设计就好了~引物25个左右的bp吧，别太短，引物的特异性挺关键的

说真的降解现在我要处理的污染物微生物种类较多，我不是学生物出身的，搞水处理的，所以我也不知道怎样找保守序列，怎样算保守序列，我现在只能从NCBI中找到这种酶的序列，序列长度大约为1500个碱基左右。附图就是文献上设计引物时用到许多不同细菌表达这种酶的基因。你能给过我举个例子吗？
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6楼2011-03-10 10:26:19
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nininini

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-03-10 10:26:19:
说真的降解现在我要处理的污染物微生物种类较多，我不是学生物出身的，搞水处理的，所以我也不知道怎样找保守序列，怎样算保守序列，我现在只能从NCBI中找到这种酶的序列，序列长度大约为1500个碱基左右。附图就 ...

我找保守序列是用的NCBI的blast功能找到在各菌株中相似度最好的片段~~不过你的片度1500bp可以直接设计引物了~保证引物的特异性就应该可以了吧
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7楼2011-03-10 15:12:23
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vs570588

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-03-10 15:12:23:
我找保守序列是用的NCBI的blast功能找到在各菌株中相似度最好的片段~~不过你的片度1500bp可以直接设计引物了~保证引物的特异性就应该可以了吧

我刚看了一下，这种酶大约由927个氨基酸，转化为碱基的话就是2781个碱基。你的意思选可以合成这种酶不同的微生物，从NCBI中查到碱基，再利用BLAST来找出不同微生物碱基最相似的部分。另外，已经报道过的引物中有兼并碱基，这是啥原因？
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8楼2011-03-10 17:11:43
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nininini

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-03-10 17:11:43:
我刚看了一下，这种酶大约由927个氨基酸，转化为碱基的话就是2781个碱基。你的意思选可以合成这种酶不同的微生物，从NCBI中查到碱基，再利用BLAST来找出不同微生物碱基最相似的部分。另外，已经报道过的引物中有 ...

不用自己查找那些微生物，直接blast可以设置微生物范围的，具体的兼并性就不清楚了~
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9楼2011-03-10 21:02:57
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