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匿名

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1楼 2009-10-17 20:25:18
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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你一定要在上游加个Nco1吗？Nco1中有个ATG起始密码子，很可能会使的阅读框错读，影响你的表达。
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2楼2009-10-17 20:40:50
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
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1、你想怎么个克隆法，先把基因克隆到T载体上呢，还是直接切PCR产物，装到pET载体上？如果先克隆到T载体上你就用不着加保护碱基，如果想直接酶切PCR产物，然后装pET载体，就要加保护碱基了，至少3个，一般为3个
2、 pET有pET28和pET32系列，每种又有abc(+)-之分，要根据你所用的是哪一个载体，才有可能考虑是否对读码框的问题，也就是蛋白在翻译的时候跟标签是in-frame-translation的，你把问题补充完整再帮你看啊
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2009-10-17 20:41:43
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匿名

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4楼2009-10-17 21:04:12
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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Originally posted by mengfei8336 at 2009-10-17 21:04:
那我换个说法，CC ATG G CA TGA ATGACAATTAAAGAAAC……，这段序列加到pET载体上，翻译从第一个ATG开始，在其后第二个密码子是终止密码子。在表达时，能不能得到我想要的蛋白（ATGACAATTAAAGAAAC……翻译的产物）？

完全可以的。
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5楼2009-10-18 00:01:00
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
启动子可以将后面的进行表达。
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6楼2009-10-18 00:01:41
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j2

木虫 (正式写手)
只要没错位就没问题
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
7楼2009-10-18 10:14:55
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
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Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-10-18 00:01:
启动子可以将后面的进行表达。

有个疑问，我看别人做融合表达的时候需要将第一个基因的终止密码子突变，做共表达需要在第二个基因前加上启动子.

在T7启动子的调控下，翻译由pET载体上的ATG开始翻译（不是从你设计引物上ATG开始），如果在目的基因上ATG翻译之前，先终止一次的话，后面的目的基因在同一个T7启动子的作用下还可以继续翻译吗？

[ Last edited by susizheng on 2009-10-18 at 15:46 ]
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Thank-you，so-blue.
8楼2009-10-18 15:34:55
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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如果按照楼主的设计，翻译先在目的基因ATG前面的终止密码子处终止，接着继续翻译目的蛋白，那样pET上的组氨酸标记没有加到目的蛋白上，会不会对以后的纯化带来困难。
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Thank-you，so-blue.
9楼2009-10-18 15:40:15
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smurfen

至尊木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-10-18 15:40:
如果按照楼主的设计，翻译先在目的基因ATG前面的终止密码子处终止，接着继续翻译目的蛋白，那样pET上的组氨酸标记没有加到目的蛋白上，会不会对以后的纯化带来困难。

可以用C端得His吧
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Advances in Prevention of Thermal Runaway in Lithium-Ion Batteries
10楼2009-10-18 15:53:11
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