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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】引物设计信息如此，touchdownPCR如何设计？
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feiye2214

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】引物设计信息如此，touchdownPCR如何设计？ 已有3人参与


这是设计的引物的详细参数，1kb的大小，Tm63左右，如何设计touchdown-PCR，因为之前跑过温度梯度，好像出现了1000bp的条带，但是还有许多短杂带，想用TD PCR来扩增特异性条带
PS:这个是根据已知物种的序列，设计未知物种的同源序列的PCR引物

各位，如何设计？
  


起始温度是不是应该高于65啦？从68度如何？每循环降低0.5度，直到62？然后62度持续？

做过TD PCR的给小弟指点指点。。。
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1楼 2010-12-16 22:07:11
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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scelab(金币+5):good 2010-12-16 22:13:29
我估计第一个温度可以直接上70度了，然后每一个循环降半度

杂带不怕，挖出目的条带克隆了测序，再设计引物P过~
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2楼2010-12-16 22:12:19
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scelab

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-16 22:12:19:
我估计第一个温度可以直接上70度了，然后每一个循环降半度

杂带不怕，挖出目的条带克隆了测序，再设计引物P过~

上面的Tm值可信吗？
同样的序列，送样单上给的和软件显示的不一样信哪个？
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小木虫之有关部门负责人
3楼2010-12-16 22:15:02
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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4楼2010-12-16 22:16:48
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-16 22:16:48:


我信合成单上50mM [Na+]的Tm，把这个值加上10度左右，做鉴定级PCR毫无压力~~
不过touch-down 可以更猛一点往上加，反正要降的……

啥是鉴定级
你用什么酶？
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小木虫之有关部门负责人
5楼2010-12-16 22:18:19
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-16 22:12:19:
我估计第一个温度可以直接上70度了，然后每一个循环降半度

杂带不怕，挖出目的条带克隆了测序，再设计引物P过~

上70度，下是62度？还是更低点？
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6楼2010-12-16 22:23:46
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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Originally posted by scelab at 2010-12-16 22:18:19:

啥是鉴定级
你用什么酶？

鉴定的意思大概就是判断有无，是非，及多少
鉴定级的就普通酶可以了
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7楼2010-12-16 23:07:38
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-12-16 22:23:46:

上70度，下是62度？还是更低点？

62也差不多了，如果条带太暗试试到60
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8楼2010-12-16 23:08:24
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