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feiye2214

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】引物设计信息如此,touchdownPCR如何设计? 已有3人参与


这是设计的引物的详细参数,1kb的大小,Tm63左右,如何设计touchdown-PCR,因为之前跑过温度梯度,好像出现了1000bp的条带,但是还有许多短杂带,想用TD PCR来扩增特异性条带
PS:这个是根据已知物种的序列,设计未知物种的同源序列的PCR引物

各位,如何设计?
  


起始温度是不是应该高于65啦?从68度如何?每循环降低0.5度,直到62?然后62度持续?

做过TD PCR的给小弟指点指点。。。
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三磷酸腺苷

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scelab(金币+5):good 2010-12-16 22:13:29
我估计第一个温度可以直接上70度了,然后每一个循环降半度

杂带不怕,挖出目的条带克隆了测序,再设计引物P过~
2楼2010-12-16 22:12:19
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scelab

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小木虫之有关部门负责人

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-16 22:12:19:
我估计第一个温度可以直接上70度了,然后每一个循环降半度

杂带不怕,挖出目的条带克隆了测序,再设计引物P过~

上面的Tm值可信吗?
同样的序列,送样单上给的和软件显示的不一样信哪个?
小木虫之有关部门负责人
3楼2010-12-16 22:15:02
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

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内容已删除
4楼2010-12-16 22:16:48
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scelab

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小木虫之有关部门负责人

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引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-16 22:16:48:


我信合成单上50mM [Na+]的Tm,把这个值加上10度左右,做鉴定级PCR毫无压力~~
不过touch-down 可以更猛一点往上加,反正要降的……

啥是鉴定级
你用什么酶?
小木虫之有关部门负责人
5楼2010-12-16 22:18:19
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feiye2214

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-16 22:12:19:
我估计第一个温度可以直接上70度了,然后每一个循环降半度

杂带不怕,挖出目的条带克隆了测序,再设计引物P过~

上70度,下是62度?还是更低点?
6楼2010-12-16 22:23:46
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三磷酸腺苷

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Originally posted by scelab at 2010-12-16 22:18:19:

啥是鉴定级
你用什么酶?

鉴定的意思大概就是判断有无,是非,及多少
鉴定级的就普通酶可以了
7楼2010-12-16 23:07:38
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-12-16 22:23:46:

上70度,下是62度?还是更低点?

62也差不多了,如果条带太暗试试到60
8楼2010-12-16 23:08:24
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