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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计的问题
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 引物设计的问题

先说明一下，我是在前人的基础上做的实验，但是这个基础有点不扎实（因为她不是很懂分子方面的东西，为了毕业论文才硬着头皮做的）。

她利用真菌的通用引物从出发菌株（自己筛选的，后来鉴定出来是产黄青霉菌）中克隆出了一个核酸片段（号称是脂肪酶，因为原始菌株有脂肪酶活性），并且已测序。我就是在这个序列的基础上开展我的工作。我要做的是克隆和真核表达这个基因。

首先要设计引物。而第一步就是要找出保守序列。我通过ncbi的blast，发现此序列中只有一个保守区段（在上游），所以上游引物可以根据这个保守区段设计。

可是下游引物应该怎样办呢？

再就是即便我克隆出了这个片段，我怎样确定它就是对应的脂肪酶的基因呢？

本人第一次求助，希望可以得到帮助啊，谢谢。
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1楼 2012-03-06 14:03:15
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jingdejun(金币+2): ★有帮助 先鼓励一下。 2012-03-06 16:13:59
西瓜(金币+2): 鼓励应助！ 2012-03-07 12:20:33
估计你应该先做反转录。可以考虑一下扩增未知片段的一些方法，比先设计随机引物（用它作为下游引物）做个热不对称交错PCR（TAIL-PCR），然后再用RACE扩增两翼的片段。对于鉴定，应该需要做蛋白质序列分析与基因编码氨基酸的序列的比对吧~~~
一家之言，仅供参考~~~
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2楼2012-03-06 15:22:20
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-03-06 15:22:20:
估计你应该先做反转录。可以考虑一下扩增未知片段的一些方法，比先设计随机引物（用它作为下游引物）做个热不对称交错PCR（TAIL-PCR），然后再用RACE扩增两翼的片段。对于鉴定，应该需要做蛋白质序列分析与基因编 ...

巢式PCR的下游引物是简并引物啊。
用随机引物可以做吗？
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3楼2012-03-06 16:13:05
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
这个，我的帖子里面好像没有提到过巢式pcr?
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4楼2012-03-06 19:55:58
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-03-06 19:55:58:
这个，我的帖子里面好像没有提到过巢式pcr?

“热不对称交错PCR（TAIL-PCR）”，也叫巢式pcr。
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5楼2012-03-06 20:53:02
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2012-03-07 12:20:10
这是两个不同的概念。
巢式PCR见http://baike.baidu.com/view/688277.htm。
TAIL-PCR见附件文献。
TAIL-PCR 中需要用到巢式PCR，但两者并不等同。
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  • 附件 1 : 一种DNA侧翼序列分离技术_TAIL_PCR.pdf
    • 2012-03-06 21:35:03, 1.23 M
6楼2012-03-06 21:35:07
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-03-06 21:35:07:
这是两个不同的概念。
巢式PCR见http://baike.baidu.com/view/688277.htm。
TAIL-PCR见附件文献。
TAIL-PCR 中需要用到巢式PCR，但两者并不等同。

不要在纠结在这个问题上了。TAIL-PCR的下游引物也是简并引物。随机引物能做吗？
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7楼2012-03-07 00:16:35
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
jingdejun(金币+1): ★有帮助 谢谢你的回答。 2012-03-07 12:00:48
本帖仅楼主可见
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8楼2012-03-07 09:03:01
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 大-木-虫 at 2012-03-07 09:03:01:
可以用tail—PCR往下步移 或者你反转录出来 在3‘段加上一个接头引物和保守区配对

我的模板是基因组DNA，反转录应该不存在吧？莫非要提取mRNA？

“tail—PCR往下步移”？怎么个移法，引物的问题怎么解决？用随机引物作为下游引物吗？
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9楼2012-03-07 12:00:29
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玉面小达摩

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据你已知的这个片段，做RACE，得到cDNA全长，再做下一步。
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对方归还借款
10楼2012-03-07 16:40:43
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