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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 引物设计的问题

先说明一下,我是在前人的基础上做的实验,但是这个基础有点不扎实(因为她不是很懂分子方面的东西,为了毕业论文才硬着头皮做的)。

她利用真菌的通用引物从出发菌株(自己筛选的,后来鉴定出来是产黄青霉菌)中克隆出了一个核酸片段(号称是脂肪酶,因为原始菌株有脂肪酶活性),并且已测序。我就是在这个序列的基础上开展我的工作。我要做的是克隆和真核表达这个基因。

首先要设计引物。而第一步就是要找出保守序列。我通过ncbi的blast,发现此序列中只有一个保守区段(在上游),所以上游引物可以根据这个保守区段设计。

可是下游引物应该怎样办呢?

再就是即便我克隆出了这个片段,我怎样确定它就是对应的脂肪酶的基因呢?

本人第一次求助,希望可以得到帮助啊,谢谢。
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

这个,我的帖子里面好像没有提到过巢式pcr?
4楼2012-03-06 19:55:58
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jingdejun(金币+2): 有帮助 先鼓励一下。 2012-03-06 16:13:59
西瓜(金币+2): 鼓励应助! 2012-03-07 12:20:33
估计你应该先做反转录。可以考虑一下扩增未知片段的一些方法,比先设计随机引物(用它作为下游引物)做个热不对称交错PCR(TAIL-PCR),然后再用RACE扩增两翼的片段。对于鉴定,应该需要做蛋白质序列分析与基因编码氨基酸的序列的比对吧~~~
一家之言,仅供参考~~~
2楼2012-03-06 15:22:20
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-03-06 15:22:20:
估计你应该先做反转录。可以考虑一下扩增未知片段的一些方法,比先设计随机引物(用它作为下游引物)做个热不对称交错PCR(TAIL-PCR),然后再用RACE扩增两翼的片段。对于鉴定,应该需要做蛋白质序列分析与基因编 ...

巢式PCR的下游引物是简并引物啊。
用随机引物可以做吗?
3楼2012-03-06 16:13:05
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-03-06 19:55:58:
这个,我的帖子里面好像没有提到过巢式pcr?

“热不对称交错PCR(TAIL-PCR)”,也叫巢式pcr。
5楼2012-03-06 20:53:02
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