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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

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[求助] 引物设计的问题

先说明一下，我是在前人的基础上做的实验，但是这个基础有点不扎实（因为她不是很懂分子方面的东西，为了毕业论文才硬着头皮做的）。

她利用真菌的通用引物从出发菌株（自己筛选的，后来鉴定出来是产黄青霉菌）中克隆出了一个核酸片段（号称是脂肪酶，因为原始菌株有脂肪酶活性），并且已测序。我就是在这个序列的基础上开展我的工作。我要做的是克隆和真核表达这个基因。

首先要设计引物。而第一步就是要找出保守序列。我通过ncbi的blast，发现此序列中只有一个保守区段（在上游），所以上游引物可以根据这个保守区段设计。

可是下游引物应该怎样办呢？

再就是即便我克隆出了这个片段，我怎样确定它就是对应的脂肪酶的基因呢？

本人第一次求助，希望可以得到帮助啊，谢谢。

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1楼 2012-03-06 14:03:15

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jingdejun

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引用回帖:

楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-03-06 15:22:20:
估计你应该先做反转录。可以考虑一下扩增未知片段的一些方法，比先设计随机引物（用它作为下游引物）做个热不对称交错PCR（TAIL-PCR），然后再用RACE扩增两翼的片段。对于鉴定，应该需要做蛋白质序列分析与基因编 ...

巢式PCR的下游引物是简并引物啊。
用随机引物可以做吗？