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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 克隆基因全长引物设计问题
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陈思容

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Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-6 16:14:

如果你只是想P出各个基因的话，这样设计就可以了。但是你P出这个基因后肯定是要研究它的功能，对它进行表达或者其他的吧。所以后面你肯定是要连到相应的载体上，对吧？如果你不设计酶切位点的话，要与目的载体连 ...

请教一个问题，我们实验室的载体是已经线性化得，有T尾，一般PCR产物会有A尾，不加酶切位点直接连可以吗？我只需要连接好了验证一下送出去测序
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11楼2009-11-06 16:22:43
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
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Originally posted by 陈思容 at 2009-11-6 16:22:

请教一个问题，我们实验室的载体是已经线性化得，有T尾，一般PCR产物会有A尾，不加酶切位点直接连可以吗？我只需要连接好了验证一下送出去测序

但是你P这个基因的时候必须是要保证这个酶是高保真的，如果这个高保真的聚合酶能加A的话就可以直接连。还有就是你这个载体可以直接测序吗？测序之后你的表达什么的也是用的这个载体吗？
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12楼2009-11-06 16:40:04
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陈思容

铜虫 (正式写手)
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Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-6 16:40:

但是你P这个基因的时候必须是要保证这个酶是高保真的，如果这个高保真的聚合酶能加A的话就可以直接连。还有就是你这个载体可以直接测序吗？测序之后你的表达什么的也是用的这个载体吗？

也就是说我P的时候要用高保真的，能加A尾的酶，对吧？我的载体是promega公司的pGEM-T easy vector,可以直接测序的！我只测序，不做表达的！
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13楼2009-11-06 16:51:37
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
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Originally posted by 陈思容 at 2009-11-6 16:51:



    也就是说我P的时候要用高保真的，能加A尾的酶，对吧？我的载体是promega公司的pGEM-T easy vector,可以直接测序的！我只测序，不做表达的！

对。你的T载体如果自身带酶切位点的话就可以不用设计酶切位点，用载体上的酶切位点了。
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14楼2009-11-06 16:53:29
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llzhang2012

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Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-6 16:14:

如果你只是想P出各个基因的话，这样设计就可以了。但是你P出这个基因后肯定是要研究它的功能，对它进行表达或者其他的吧。所以后面你肯定是要连到相应的载体上，对吧？如果你不设计酶切位点的话，要与目的载体连 ...

谢谢！
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15楼2009-11-06 19:05:54
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1081612

铜虫 (小有名气)
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引物设计要按原则来  有软件可以用 不是简单的数前后十几个bp就行
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16楼2009-11-06 19:34:19
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zhuifeng7000

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Originally posted by 1081612 at 2009-11-6 19:34:
引物设计要按原则来  有软件可以用 不是简单的数前后十几个bp就行

既然这样的话，你如果要拉全长的基因你要怎么设计引物呢？
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17楼2009-11-07 13:01:39
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pidou213

木虫 (正式写手)
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用primer primer5设计引物，排除二聚体、错配、等影响因素
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见得多爱的多
18楼2009-11-07 13:32:34
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zhuifeng7000

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Originally posted by pidou213 at 2009-11-7 13:32:
用primer primer5设计引物，排除二聚体、错配、等影响因素

但是前提是你要把全长的基因P出来吧！你primer primer5把二聚体、错配、等影响因素都排除了，选个打分最高的引物，这样还能把全长基因P出来吗？
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19楼2009-11-07 15:40:36
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xuezhen

银虫 (小有名气)
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Originally posted by wangqk198738 at 2009-11-6 07:32:
要是基因不长，在一千到两千bp那就设计一个引物，要是很长就分段设计，逐步克隆，引物长度一般在12-25bp。有专门的引物设计软件，很好用的，你都知道全场了，想必是什么都知道了，那就对照着做好了，挑选一段特异 ...

请问怎么分段设计，对于较大的片段？
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20楼2009-11-07 16:01:53
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