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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 克隆基因全长引物设计问题
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

适当的均分

★
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你看看多大就行了，这还不好办吗？合适，特异性好，就可以了
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21楼2009-11-07 18:20:18
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pidou213

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-7 15:40:

但是前提是你要把全长的基因P出来吧！你primer primer5把二聚体、错配、等影响因素都排除了，选个打分最高的引物，这样还能把全长基因P出来吗？

如果设计软件就能决定一切的话，恐怕就不用实验了。我希望楼主在软件认可的情况下，去做实验证实一下是最好的解决方案啊
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见得多爱的多
22楼2009-11-07 22:24:32
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yangjunzju

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by wangqk198738 at 2009-11-07 18:20:18:
你看看多大就行了，这还不好办吗？合适，特异性好，就可以了

如果用引物设计软件如primer premier 5,怎样设计引物才能将全长的基因P出来呢？谢谢
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23楼2010-03-14 19:47:03
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咖啡加点糖

木虫 (小有名气)
★
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解决了我不懂得问题，好贴啊，才发现！
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24楼2011-04-21 20:53:55
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
其实前后找两段序列退火别差太多基本都能扩出来了
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25楼2011-04-22 14:24:18
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zhengqiuyang

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lstt09nk(金币+2): 感谢参与，欢迎常来 2011-04-25 20:48:30
你可以选择T载体进行连接，可以提高克隆的效率。或者可以根据你的载体上的酶切位点，最好是选择不一样的两个酶切位点，这样可以避免克隆进去的目的片段方向反了。关于保护碱基的话，可以去网上搜索一下，针对不同的限制性内切酶都有提供不同的保护碱基的。还有在你的起始密码子ATG之前一般要加一端GCCACC，可以增强表达效率，如果你的目的基因需要添加标签的话，注意要去掉你的终止密码子。
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26楼2011-04-25 14:34:07
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sd3824289

木虫 (正式写手)
引物设计应注意如下要点：  
1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。  

2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。  

3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。  

4 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。  

5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。  

6  ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。  

7 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。  

8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
    另外本人建议楼主在论坛里搜索一下primer 5.0软件！很好用的！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
27楼2012-07-25 16:36:12
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lixtong

铜虫 (小有名气)
学习了～
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28楼2012-09-01 08:41:38
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行者，有路

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不错 新手刚报到 很有用 多谢！
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29楼2012-11-06 15:12:39
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xjzw

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16526520楼: Originally posted by pidou213 at 2009-11-07 22:24:32
如果设计软件就能决定一切的话，恐怕就不用实验了。我希望楼主在软件认可的情况下，去做实验证实一下是最好的解决方案啊...

就是的，是先用软件设计一下，作为一个参考，最终还是得用实验结果说话，现在不都是用软件嘛，结合着来。
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30楼2012-11-06 16:30:10
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