24小时热门版块排行榜    

查看: 1229  |  回复: 9
本帖产生 1 个 MolEPI ,点击这里进行查看

vs570588

木虫 (正式写手)

[求助] 怎样建立基因文库,以及用它建立生物发育树

我的问题,用污泥驯化富集可以降解某种特定污染物的混合菌,现在要分析微生物菌落结构。想通过建立基因文库。来建立系统发育树。原来的方法是做DGGE,再进行克隆,测序。发现大量外文文献里,很少做DGGE,普遍方法是,做完PCR后,就纯化,克隆,测序,不过测序量十分大。我是个初学者,希望大家能提供详细的过程。另外大家能评价下,DGGE后的克隆测序做系统发育树和直接PCR后克隆测序用啥区别?当然引物用一样的。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

vs570588

木虫 (正式写手)

那我要顶顶,没有人做过吗
2楼2011-06-11 13:39:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuheng19831123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
vs570588(金币+1): 谢谢 2011-06-12 09:49:31
西瓜(金币+4): 鼓励应助。高人噢! 2011-06-12 17:48:15
我是专做dgge的 感觉先做这个可以有一个大概的,显著的,有针对性的了解一个微生物生态系统中有哪些菌,哪些多些。有一个明显的比较。
直接PCR就大海撒网了 克隆出啥就是啥 只能知道有他这玩意儿,是多是少就不晓得了,有些时候克隆出的可能是数量很微小的不具代表性的细菌种群。。。。。。。。。。。。。。
3楼2011-06-11 18:19:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

vs570588

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yuheng19831123 at 2011-06-11 18:19:55:
我是专做dgge的 感觉先做这个可以有一个大概的,显著的,有针对性的了解一个微生物生态系统中有哪些菌,哪些多些。有一个明显的比较。
直接PCR就大海撒网了 克隆出啥就是啥 只能知道有他这玩意儿,是多是少就不晓 ...

我的问题是这样的,DGGE只能跑PCR产物为几百的片段。但我们以前用引物534,和341,DGGE做出来还可以,但是切胶克隆测序后,序列根本就没有办法和已知GENBANK里的基因进行对比。所以我们就决定换引物,换引物后,片段可能要很长,所以用DGGE做不可能了。你能说说DGGE一般可以做的片段长度为多少?假如不做的DGGE的话,直接克隆出来,是不要送很多样去测序,才有意义?
4楼2011-06-12 09:53:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuheng19831123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good!一并奖励了。 2011-06-12 17:49:05
vs570588(金币+1): 有道理 2011-06-13 10:02:50
引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-06-12 09:53:40:
我的问题是这样的,DGGE只能跑PCR产物为几百的片段。但我们以前用引物534,和341,DGGE做出来还可以,但是切胶克隆测序后,序列根本就没有办法和已知GENBANK里的基因进行对比。所以我们就决定换引物,换引物后 ...

一般是100多到500这样子的,再大就不能良好的分析了 ,这是DGGE的一个缺陷,你原来的是190多的片段吧 ,好像是V3 的吧,太短了点,现在一般要求做长点了 V3-V6左右吧 ,还有本来你的样品中就是许多不可培养细菌,没有比对上的也可能正常,不过V3 的确也太短了。
5楼2011-06-12 12:53:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gayalynau

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

vs570588(金币+2): 好的谢谢 2011-06-13 10:03:39
如果做文库,强烈建议用F27和R1492引物直接扩展克隆后测序,一般来说要送样100个,当然用SHANNON指数等软件可以计算出最低送样量,考虑到现在测序费用降低,从我们发表了16S全长的文库来看,送样120-150个就OK,根据OTU在做树,具体方法的优缺点可以参考我的一篇综述:
Mol Biol Rep. 2008 Jun;35(2):265-74. Epub 2007 May 5.
The use of molecular techniques based on ribosomal RNA and DNA for rumen microbial ecosystem studies: a review. (它引10次)

尽管是做瘤胃微生物,套路一样,只是样品来源不同而已。

DGGE适合于在做完文库后筛选优势菌,可以用这个方法,
6楼2011-06-12 19:25:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

vs570588

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-06-12 09:53:40:
我的问题是这样的,DGGE只能跑PCR产物为几百的片段。但我们以前用引物534,和341,DGGE做出来还可以,但是切胶克隆测序后,序列根本就没有办法和已知GENBANK里的基因进行对比。所以我们就决定换引物,换引物后 ...

你好,我还有个问题,现在我们定的引物来源于英文文献上,引物基于功能性酶基因设计,出来片段长度大概就是400bp,并没有给引物上设计夹子,人家也做了DGGE,所以我们在订购这些引物时需要让制作引物的公司给带上夹子吗?
7楼2011-06-13 10:16:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

vs570588

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by gayalynau at 2011-06-12 19:25:17:
如果做文库,强烈建议用F27和R1492引物直接扩展克隆后测序,一般来说要送样100个,当然用SHANNON指数等软件可以计算出最低送样量,考虑到现在测序费用降低,从我们发表了16S全长的文库来看,送样120-150个就OK,根 ...

其实这中送样,我还是有些不懂,我们拿的是培养皿做克隆。你也知道转化后一个培养皿里可以克隆出很多菌落,是不我们就把整个培养皿拿去测序就可以。还有一个问题,我不太懂,就是这样子克隆出来是不容易出现非单体克隆?
8楼2011-06-13 10:21:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gayalynau

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-06-13 10:21:46:
其实这中送样,我还是有些不懂,我们拿的是培养皿做克隆。你也知道转化后一个培养皿里可以克隆出很多菌落,是不我们就把整个培养皿拿去测序就可以。还有一个问题,我不太懂,就是这样子克隆出来是不容易出现非 ...

随机挑选,肯定有的测出来的是重复的,则说明是优势细菌
9楼2011-06-14 13:12:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuheng19831123

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-06-13 10:16:02:
你好,我还有个问题,现在我们定的引物来源于英文文献上,引物基于功能性酶基因设计,出来片段长度大概就是400bp,并没有给引物上设计夹子,人家也做了DGGE,所以我们在订购这些引物时需要让制作引物的公司给带上 ...

做DGGE的当然要上夹子啦,400比较长了
10楼2011-06-15 19:13:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 vs570588 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 国内期刊审稿人数量 +3 新时代核动力驴 2024-11-13 4/200 2024-11-15 06:33 by steven_198377
[论文投稿] chemical science和advanced science哪个好一点 +5 yly150 2024-11-12 5/250 2024-11-15 01:09 by ca0yan9
[教师之家] 大学老师 +9 考研一路顺风 2024-11-13 11/550 2024-11-14 21:47 by EndNoted
[基金申请] 去年七月底入站的还能申请下一批吗? +3 brightwo 2024-11-14 3/150 2024-11-14 21:17 by 实验小白ha
[论文投稿] 投稿系统中的通讯作者和文章中的通讯作者不一样,文章目前被录用了? +4 babybabygo 2024-11-12 5/250 2024-11-14 19:13 by 走了002
[教师之家] 北大教授何怀宏曾如此描述他的同行 +11 zju2000 2024-11-09 11/550 2024-11-14 18:14 by frks
[教师之家] 这种人痛苦吗 +11 2671 2024-11-12 12/600 2024-11-14 16:50 by syl200707
[硕博家园] 研究生的生活该是什么样 +4 lqy0719 2024-11-14 4/200 2024-11-14 16:45 by 阿荣喝酒
[基金申请] 广东省自然科学基金-面上项目消息有了么? +4 pachang 2024-11-14 5/250 2024-11-14 16:41 by owenyaa
[基金申请] 博后资助名单出来了 +10 Shxjjxjkx 2024-11-14 12/600 2024-11-14 16:07 by Vincent1900
[教师之家] 处在人生职业的分水岭 +4 otani 2024-11-13 4/200 2024-11-14 14:17 by mddzwo
[找工作] 咨询一下江西的高校待遇,人文氛围怎么样? +5 akslis2024 2024-11-09 5/250 2024-11-14 13:53 by 啄木鸟、
[基金申请] 76批博后基金 +3 feiyi3986 2024-11-14 3/150 2024-11-14 11:50 by puly
[基金申请] 第76批博士后面上大概什么时间公示 +6 探际者 2024-11-11 7/350 2024-11-14 10:06 by Foxicut88
[教师之家] 评正教授需要两个国家级项目,有人用子课题糊弄,结果在评审前资格公示时被举报拿下了 +20 瞬息宇宙 2024-11-12 29/1450 2024-11-13 08:49 by Quakerbird
[论文投稿] 爱思唯尔投稿系统里的通讯作者可以和文章里的通讯作者标注不同吗 +7 Omnissiah 2024-11-10 7/350 2024-11-12 14:07 by holypower
[有机交流] 求助NMR +5 苯巴比妥! 2024-11-09 5/250 2024-11-12 11:20 by 88817753
[基金申请] 请问:工作单位缺乏条件,青年基金申报书可以写读博学校的实验平台吗? +5 dxmx 2024-11-08 7/350 2024-11-11 23:08 by dxcharlary
[硕博家园] 同步辐射 +4 小张要加油努力 2024-11-10 7/350 2024-11-11 13:47 by mpdfwxgui
[考博] 985硕 电池方向考博 +3 物化w7wx 2024-11-08 5/250 2024-11-11 09:38 by 物化w7wx
信息提示
请填处理意见