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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎样建立基因文库，以及用它建立生物发育树
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vs570588

木虫 (正式写手)

[求助] 怎样建立基因文库，以及用它建立生物发育树

我的问题，用污泥驯化富集可以降解某种特定污染物的混合菌，现在要分析微生物菌落结构。想通过建立基因文库。来建立系统发育树。原来的方法是做DGGE,再进行克隆，测序。发现大量外文文献里，很少做DGGE,普遍方法是，做完PCR后，就纯化，克隆，测序，不过测序量十分大。我是个初学者，希望大家能提供详细的过程。另外大家能评价下，DGGE后的克隆测序做系统发育树和直接PCR后克隆测序用啥区别？当然引物用一样的。
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1楼 2011-06-10 16:19:24
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vs570588

木虫 (正式写手)
那我要顶顶，没有人做过吗
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2楼2011-06-11 13:39:55
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yuheng19831123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
vs570588(金币+1): 谢谢 2011-06-12 09:49:31
西瓜(金币+4): 鼓励应助。高人噢！ 2011-06-12 17:48:15
我是专做dgge的 感觉先做这个可以有一个大概的，显著的，有针对性的了解一个微生物生态系统中有哪些菌，哪些多些。有一个明显的比较。
直接PCR就大海撒网了 克隆出啥就是啥 只能知道有他这玩意儿，是多是少就不晓得了，有些时候克隆出的可能是数量很微小的不具代表性的细菌种群。。。。。。。。。。。。。。
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3楼2011-06-11 18:19:55
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vs570588

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yuheng19831123 at 2011-06-11 18:19:55:
我是专做dgge的 感觉先做这个可以有一个大概的，显著的，有针对性的了解一个微生物生态系统中有哪些菌，哪些多些。有一个明显的比较。
直接PCR就大海撒网了 克隆出啥就是啥 只能知道有他这玩意儿，是多是少就不晓 ...

我的问题是这样的，DGGE只能跑PCR产物为几百的片段。但我们以前用引物534，和341，DGGE做出来还可以，但是切胶克隆测序后，序列根本就没有办法和已知GENBANK里的基因进行对比。所以我们就决定换引物，换引物后，片段可能要很长，所以用DGGE做不可能了。你能说说DGGE一般可以做的片段长度为多少？假如不做的DGGE的话，直接克隆出来，是不要送很多样去测序，才有意义？
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4楼2011-06-12 09:53:40
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yuheng19831123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！一并奖励了。 2011-06-12 17:49:05
vs570588(金币+1): 有道理 2011-06-13 10:02:50
引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-06-12 09:53:40:
我的问题是这样的，DGGE只能跑PCR产物为几百的片段。但我们以前用引物534，和341，DGGE做出来还可以，但是切胶克隆测序后，序列根本就没有办法和已知GENBANK里的基因进行对比。所以我们就决定换引物，换引物后 ...

一般是100多到500这样子的，再大就不能良好的分析了 ，这是DGGE的一个缺陷，你原来的是190多的片段吧 ，好像是V3 的吧，太短了点，现在一般要求做长点了 V3-V6左右吧 ，还有本来你的样品中就是许多不可培养细菌，没有比对上的也可能正常，不过V3 的确也太短了。
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5楼2011-06-12 12:53:34
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gayalynau

铁杆木虫 (著名写手)

嗨

【答案】应助回帖

vs570588(金币+2): 好的谢谢 2011-06-13 10:03:39
如果做文库，强烈建议用F27和R1492引物直接扩展克隆后测序，一般来说要送样100个，当然用SHANNON指数等软件可以计算出最低送样量，考虑到现在测序费用降低，从我们发表了16S全长的文库来看，送样120-150个就OK，根据OTU在做树，具体方法的优缺点可以参考我的一篇综述：
Mol Biol Rep. 2008 Jun;35(2):265-74. Epub 2007 May 5.
The use of molecular techniques based on ribosomal RNA and DNA for rumen microbial ecosystem studies: a review. （它引10次）

尽管是做瘤胃微生物，套路一样，只是样品来源不同而已。

DGGE适合于在做完文库后筛选优势菌，可以用这个方法，
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嗨
6楼2011-06-12 19:25:17
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vs570588

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-06-12 09:53:40:
我的问题是这样的，DGGE只能跑PCR产物为几百的片段。但我们以前用引物534，和341，DGGE做出来还可以，但是切胶克隆测序后，序列根本就没有办法和已知GENBANK里的基因进行对比。所以我们就决定换引物，换引物后 ...

你好，我还有个问题，现在我们定的引物来源于英文文献上，引物基于功能性酶基因设计，出来片段长度大概就是400bp,并没有给引物上设计夹子，人家也做了DGGE,所以我们在订购这些引物时需要让制作引物的公司给带上夹子吗？
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7楼2011-06-13 10:16:02
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vs570588

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gayalynau at 2011-06-12 19:25:17:
如果做文库，强烈建议用F27和R1492引物直接扩展克隆后测序，一般来说要送样100个，当然用SHANNON指数等软件可以计算出最低送样量，考虑到现在测序费用降低，从我们发表了16S全长的文库来看，送样120-150个就OK，根 ...

其实这中送样，我还是有些不懂，我们拿的是培养皿做克隆。你也知道转化后一个培养皿里可以克隆出很多菌落，是不我们就把整个培养皿拿去测序就可以。还有一个问题，我不太懂，就是这样子克隆出来是不容易出现非单体克隆？
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8楼2011-06-13 10:21:46
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gayalynau

铁杆木虫 (著名写手)

嗨
引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-06-13 10:21:46:
其实这中送样，我还是有些不懂，我们拿的是培养皿做克隆。你也知道转化后一个培养皿里可以克隆出很多菌落，是不我们就把整个培养皿拿去测序就可以。还有一个问题，我不太懂，就是这样子克隆出来是不容易出现非 ...

随机挑选，肯定有的测出来的是重复的，则说明是优势细菌
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嗨
9楼2011-06-14 13:12:44
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yuheng19831123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by vs570588 at 2011-06-13 10:16:02:
你好，我还有个问题，现在我们定的引物来源于英文文献上，引物基于功能性酶基因设计，出来片段长度大概就是400bp,并没有给引物上设计夹子，人家也做了DGGE,所以我们在订购这些引物时需要让制作引物的公司给带上 ...

做DGGE的当然要上夹子啦，400比较长了
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10楼2011-06-15 19:13:26
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