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【求助/交流】目的基因连接表达载体后涂板不长菌 已有3人参与
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| 将目的基因和表达载体用两个限制性酶切后16度过夜连接，后转化DH5α37度过夜培养竟然一个菌也没有长，理论上说即使没有连接成功也应该有空载体转化成功呀，怎么能一个菌也不长呢？求高手指点 |
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tianyinghu
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lstt09nk(金币+5):不错，欢迎常来~ 2010-10-09 14:18:56
yuanalice(金币+2): 2010-10-10 12:21:35
lstt09nk(金币+5):不错，欢迎常来~ 2010-10-09 14:18:56
yuanalice(金币+2): 2010-10-10 12:21:35
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首先 1，确定你的载体抗性没有错，没有拿错载体，第二回收浓度是多少。 2.你的抗性板有没有弄错 3.上面2点建议做个质粒转化，就拿你做酶切的质粒。再加上你确实的同抗性的其他质粒，看长不长 如果长，那就说明板和载体应该是没问题，如果不长（一个长一个不长或是2个都不长），可能有4个原因， 第一 载体错了 第二 板错了 第三 连接不没连接成功 第四 感受态有问题（2个质粒都不长） 排除以上几点后如果确定是连接没成功，很简单载体酶切后回收下来测个浓度，还有片度，按照适当的比例连接，建议别16度过夜，我一般是用22度2个小时就可以了，16度四小时，或是4度过夜，如果你时间来不急你可以22都连接一段时间然后放到四度，第2天转化，因为很多实验室质粒放过夜会见解的，可能是和用的水有关系。我见过最严重的是2小时质粒就见解的，所以建议你提质粒的时候要注意。 |
4楼2010-10-09 14:17:33
walker2898
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2楼2010-10-09 11:09:27
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lstt09nk(金币+2):鼓励交流，欢迎常来~ 2010-10-09 18:17:57
yuanalice(金币+1): 2010-10-10 12:22:16
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yuanalice(金币+1): 2010-10-10 12:22:16
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我想了解你的载体和片段的长度，以及两个限制性内切酶，一般情况下，什么斑都不长，除了tianyinghu 前面提到以外，还有小细节，比如可能把菌在涂板时烫死了，当然这种事情应该是小概率事件，还有做分子克隆实验，一定要留一半，以便于对前面的步骤进行分析。 举例：酶切后，一半用于酶连接，剩下的，可以电泳看是否切开；酶连接可以留点跑电泳，看酶连的是否有，其余用于转化 等等 要注意留一半，并不是绝对的一半量，足够你用于分析的量就行了 祝你试验成功 |
6楼2010-10-09 14:38:42
3楼2010-10-09 11:23:36
tianyinghu
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5楼2010-10-09 14:19:51
7楼2010-10-09 15:06:07
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amisking(金币+3):good！ 2010-10-09 20:33:39
yuanalice(金币+1): 2010-10-10 12:22:48
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yuanalice(金币+1): 2010-10-10 12:22:48
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做分子，做出来什么都好说！可做不出来，就很让人头疼了，因为各个环节都可能出现问题！ 首先，酶切。确定目的产物无误，确定已经切开，确定质粒无误，确定质粒已经切开； 然后，连接。如果连接酶没问题，缓冲液没问题的话，基本不会有问题； 然后，转化。连接体系的话，估计应该是化学转化吧。那就应该考虑感受态的转化效率。现在一般使用试剂盒，建议使用口碑较好的试剂盒。 然后，复苏。如果保证没有在复苏液中添加抗性，应该不会有问题。 然后，涂布。抗性板，抗性浓度都确定无误的话，应注意因为涂布器的过热导致细菌烫死也是可能的，尽管是小概率事件！ 最后就是试验次数问题了。试验次数不够往往会经验不足，所以多做几次吧！ |
8楼2010-10-09 19:14:11
yixuanwin
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