| 查看: 3740 | 回复: 11 | |||
[交流]
【求助/交流】目的基因连接表达载体后涂板不长菌已有3人参与
|
|||
| 将目的基因和表达载体用两个限制性酶切后16度过夜连接，后转化DH5α37度过夜培养竟然一个菌也没有长，理论上说即使没有连接成功也应该有空载体转化成功呀，怎么能一个菌也不长呢？求高手指点 |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有88人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
那些大肠杆菌感受态是Dam+型，基因可被DpnI降解
已经有6人回复- 两个基因融合构建真核表达载体需要去掉信号肽吗?
已经有7人回复
- 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
已经有54人回复
- 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
已经有24人回复
- 目的片段与表达载体的连接
已经有23人回复
- 目的片段和T1载体连接后转入感受态细胞涂板子总不长菌……
已经有7人回复
- 目的基因连接pGEX-6p-1进行转化的问题
已经有14人回复
- 根据已知序列，从相同菌种(菌株编号不同)中能PCR出目的基因吗？
已经有6人回复
- 已知全长基因怎样克隆并构建表达载体
已经有8人回复
- 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
已经有24人回复
- 克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？
已经有17人回复
- 【求助/交流】目的基因与pPIC9K连接的问题！
已经有9人回复
- 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办
已经有17人回复
- 【求助/交流】转有空质粒的菌跟转有目的基因的重组质粒的菌哪个生长快？
已经有3人回复
- 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌表达的目的蛋白没活性，可以考虑换什么表达载体？
已经有7人回复
tianyinghu
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 1
- 应助: 23 (小学生)
- 金币: 527.5
- 红花: 1
- 帖子: 52
- 在线: 43.9小时
- 虫号: 502164
- 注册: 2008-02-14
- 专业: 生物大分子结构与功能
★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5):不错，欢迎常来~ 2010-10-09 14:18:56
yuanalice(金币+2): 2010-10-10 12:21:35
lstt09nk(金币+5):不错，欢迎常来~ 2010-10-09 14:18:56
yuanalice(金币+2): 2010-10-10 12:21:35
|
首先 1，确定你的载体抗性没有错，没有拿错载体，第二回收浓度是多少。 2.你的抗性板有没有弄错 3.上面2点建议做个质粒转化，就拿你做酶切的质粒。再加上你确实的同抗性的其他质粒，看长不长 如果长，那就说明板和载体应该是没问题，如果不长（一个长一个不长或是2个都不长），可能有4个原因， 第一 载体错了 第二 板错了 第三 连接不没连接成功 第四 感受态有问题（2个质粒都不长） 排除以上几点后如果确定是连接没成功，很简单载体酶切后回收下来测个浓度，还有片度，按照适当的比例连接，建议别16度过夜，我一般是用22度2个小时就可以了，16度四小时，或是4度过夜，如果你时间来不急你可以22都连接一段时间然后放到四度，第2天转化，因为很多实验室质粒放过夜会见解的，可能是和用的水有关系。我见过最严重的是2小时质粒就见解的，所以建议你提质粒的时候要注意。 |
4楼2010-10-09 14:17:33
walker2898
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 455.5
- 散金: 1
- 帖子: 178
- 在线: 25.2小时
- 虫号: 599350
- 注册: 2008-09-11
- 专业: 作物种质资源与遗传育种学
2楼2010-10-09 11:09:27
★ ★
lstt09nk(金币+2):鼓励交流，欢迎常来~ 2010-10-09 18:17:57
yuanalice(金币+1): 2010-10-10 12:22:16
lstt09nk(金币+2):鼓励交流，欢迎常来~ 2010-10-09 18:17:57
yuanalice(金币+1): 2010-10-10 12:22:16
|
我想了解你的载体和片段的长度，以及两个限制性内切酶，一般情况下，什么斑都不长，除了tianyinghu 前面提到以外，还有小细节，比如可能把菌在涂板时烫死了，当然这种事情应该是小概率事件，还有做分子克隆实验，一定要留一半，以便于对前面的步骤进行分析。 举例：酶切后，一半用于酶连接，剩下的，可以电泳看是否切开；酶连接可以留点跑电泳，看酶连的是否有，其余用于转化 等等 要注意留一半，并不是绝对的一半量，足够你用于分析的量就行了 祝你试验成功 |
6楼2010-10-09 14:38:42
3楼2010-10-09 11:23:36
tianyinghu
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 1
- 应助: 23 (小学生)
- 金币: 527.5
- 红花: 1
- 帖子: 52
- 在线: 43.9小时
- 虫号: 502164
- 注册: 2008-02-14
- 专业: 生物大分子结构与功能
5楼2010-10-09 14:19:51
7楼2010-10-09 15:06:07
★ ★ ★
amisking(金币+3):good！ 2010-10-09 20:33:39
yuanalice(金币+1): 2010-10-10 12:22:48
amisking(金币+3):good！ 2010-10-09 20:33:39
yuanalice(金币+1): 2010-10-10 12:22:48
|
做分子，做出来什么都好说！可做不出来，就很让人头疼了，因为各个环节都可能出现问题！ 首先，酶切。确定目的产物无误，确定已经切开，确定质粒无误，确定质粒已经切开； 然后，连接。如果连接酶没问题，缓冲液没问题的话，基本不会有问题； 然后，转化。连接体系的话，估计应该是化学转化吧。那就应该考虑感受态的转化效率。现在一般使用试剂盒，建议使用口碑较好的试剂盒。 然后，复苏。如果保证没有在复苏液中添加抗性，应该不会有问题。 然后，涂布。抗性板，抗性浓度都确定无误的话，应注意因为涂布器的过热导致细菌烫死也是可能的，尽管是小概率事件！ 最后就是试验次数问题了。试验次数不够往往会经验不足，所以多做几次吧！ |
8楼2010-10-09 19:14:11
yixuanwin
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 22 (小学生)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 5937.7
- 红花: 1
- 帖子: 431
- 在线: 40.2小时
- 虫号: 719137
- 注册: 2009-03-10
- 性别: GG
- 专业: 基因组学
9楼2010-10-09 19:55:28
10楼2010-10-10 12:25:10