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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】目的基因连接表达载体后涂板不长菌
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yuanalice

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】目的基因连接表达载体后涂板不长菌已有3人参与

将目的基因和表达载体用两个限制性酶切后16度过夜连接，后转化DH5α37度过夜培养竟然一个菌也没有长，理论上说即使没有连接成功也应该有空载体转化成功呀，怎么能一个菌也不长呢？求高手指点
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1楼2010-10-09 11:01:15
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sweetbobo

银虫 (小有名气)
★ ★
lstt09nk(金币+2):鼓励交流，欢迎常来~ 2010-10-09 18:17:57
yuanalice(金币+1): 2010-10-10 12:22:16
我想了解你的载体和片段的长度，以及两个限制性内切酶，一般情况下，什么斑都不长，除了tianyinghu  
前面提到以外，还有小细节，比如可能把菌在涂板时烫死了，当然这种事情应该是小概率事件，还有做分子克隆实验，一定要留一半，以便于对前面的步骤进行分析。
举例：酶切后，一半用于酶连接，剩下的，可以电泳看是否切开；酶连接可以留点跑电泳，看酶连的是否有，其余用于转化 等等
要注意留一半，并不是绝对的一半量，足够你用于分析的量就行了
祝你试验成功
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6楼2010-10-09 14:38:42
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walker2898

银虫 (小有名气)
yuanalice(金币+2): 2010-10-09 12:48:59
yuanalice(金币+2): 2010-10-10 12:24:28
个人认为一是你的载体脱磷效果好，所以没有自连的；二是连接不成功，所以不长菌。不知楼主用什么酶切的？酶切多长时间？用的什么连接酶？
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2楼2010-10-09 11:09:27
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yuanalice

银虫 (小有名气)
内切酶是NcoⅠ和XholⅠ,切了四个小时，连接酶是T4ligase.多谢！
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3楼2010-10-09 11:23:36
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tianyinghu

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5):不错，欢迎常来~ 2010-10-09 14:18:56
yuanalice(金币+2): 2010-10-10 12:21:35
首先
1，确定你的载体抗性没有错，没有拿错载体，第二回收浓度是多少。
2.你的抗性板有没有弄错
3.上面2点建议做个质粒转化，就拿你做酶切的质粒。再加上你确实的同抗性的其他质粒，看长不长
  如果长，那就说明板和载体应该是没问题，如果不长（一个长一个不长或是2个都不长），可能有4个原因，
第一   载体错了   第二  板错了    第三 连接不没连接成功   第四  感受态有问题（2个质粒都不长）


    排除以上几点后如果确定是连接没成功，很简单载体酶切后回收下来测个浓度，还有片度，按照适当的比例连接，建议别16度过夜，我一般是用22度2个小时就可以了，16度四小时，或是4度过夜，如果你时间来不急你可以22都连接一段时间然后放到四度，第2天转化，因为很多实验室质粒放过夜会见解的，可能是和用的水有关系。我见过最严重的是2小时质粒就见解的，所以建议你提质粒的时候要注意。
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4楼2010-10-09 14:17:33
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