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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
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likii

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？ 已有10人参与

向各位高手请教：回收连接转化哪里出了问题？
实验过程是这样的：
目的片段只有700多bp，是普通的PCR产物经过回收试剂盒（bioer）回收得到，条带也很亮，也很单一. 连接是在PCR仪中16度连接的，十二个小时左右，然后用TAKARAde pmd18t载体连接的，而后转入感受态中，培养十二小时之后，菌长的很少，蓝白斑都有，但是白斑都是假阳性，有质粒的序列，却没有目的片段。于是我猜想或许是我加样的问题，而后又重新做了一次，依然如此，白斑都是假阳性，质粒的空载体。然后换了一个连接的试剂盒，PGEM载体连接，这次菌长的都少了，而且蓝斑很多，两个板子一个没有长，一个上面只挑得出五个单克隆。经过检测都是假阳性，没有目的片段。不知道是哪里出了问题，感受态是最近几天配的，有菌落长出来，应该不是感受态的问题吧？蓝白斑筛选也没有错，会不会x-gal和IPTG失效，可是有蓝斑也有白斑，应该不是他们吧，其他的我就不知道了，pmd18-T质粒是新买的，按理说也不会的吧，培养基都是新配的。在我之后我师兄做了几次连接也是相同的情况，只有空的质粒，没有目的片段，而且平板上都是蓝斑，白斑很少，不知道哪里有问题，请各位精通的大师帮忙分析一下~~万分感谢！！！
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加油，发文章，发好文章~
1楼 2010-11-26 17:22:00
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-11-27 08:44:50
确定回收没问题的话，考虑一下连接问题，是不是连接体系有问题，目的片段：载体=（3~10）：1
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5楼2010-11-26 19:48:37
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
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lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-26 18:38:17
为什么要用连接试剂盒呢？
直接酶切，然后ligase一样就可以了；一般蓝白斑筛选就可以筛选出来的，至于为什么没有目的基因序列，不知道你是怎么验证的？pcr还是提质粒酶切验证的?

我的建议：重新连接，然后转化...........
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2010-11-26 17:53:51
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likii

铜虫 (小有名气)

菌液PCR检测的

★ ★ ★
dhd997(金币+3):鼓励新虫交流 2010-11-27 08:44:28
检测就是菌液PCR然后电泳检测的，经过我的描述你应该知道我们已经重复了五次了~~就是把目的片段连接到质粒里面啊，我好像没有说连接试剂盒的哦~~谢谢你哦~~
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加油，发文章，发好文章~
3楼2010-11-26 18:16:58
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likii

铜虫 (小有名气)

兼并引物做出来的片段

呵呵，我不太懂那个算是连接试剂盒，我们是兼并引物做出来的片段，所以没法设计特异性接头进行酶切。。。。衰啊。。。
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加油，发文章，发好文章~
4楼2010-11-26 18:19:54
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likii

铜虫 (小有名气)

怎么确定怎么回收没有问题~~

dhd997:建议引用回复，方便虫友看到，及时回答问题。 2010-11-27 08:45:23
怎么确定怎么回收没有问题啊？我回收出的条带很单一也很亮，不知道怎么确定它有没问题~~
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加油，发文章，发好文章~
6楼2010-11-26 20:16:33
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by likii at 2010-11-26 20:16:33:
怎么确定怎么回收没有问题啊？我回收出的条带很单一也很亮，不知道怎么确定它有没问题~~

你回收之后跑个电泳看下就好了
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7楼2010-11-27 09:10:13
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大白菜123789

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议PCR完切胶回收，直接连PMD18T，一直都是这么做的，效果很好
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8楼2010-11-27 09:19:39
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)
★
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1 将目的片段与载体按比例混匀
2  65-70度热击2-3Min，破坏目的片段与载体的二级结构
3 加入l连接酶
4 16度连接过夜
5 将有克隆的平板在4度内放置半天显色
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9楼2010-11-27 09:35:08
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森林女巫

新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
Originally posted by likii at 2010-11-26 17:22:00:
向各位高手请教：回收连接转化哪里出了问题？
实验过程是这样的：
目的片段只有700多bp，是普通的PCR产物经过回收试剂盒（bioer）回收得到，条带也很亮，也很单一. 连接是在PCR仪中16度连接的，十二个小时左右， ...

空载体就是说质粒没有转进去，如果目的片段回收和纯化以及连接都没有问题的话，可以试试转化方式，还有在涂菌的时候注意灭菌消毒。祝你成功哦
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10楼2010-11-27 10:36:23
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