Originally posted by likii at 2010-11-26 17:22:00:
向各位高手请教：回收连接转化哪里出了问题？
实验过程是这样的：
目的片段只有700多bp，是普通的PCR产物经过回收试剂盒（bioer）回收得到，条带也很亮，也很单一. 连接是在PCR仪中16度连接的，十二个小时左右， ...

Originally posted by yuanbo934 at 2010-11-27 09:35:08:
1 将目的片段与载体按比例混匀
2  65-70度热击2-3Min，破坏目的片段与载体的二级结构
3 加入l连接酶
4 16度连接过夜
5 将有克隆的平板在4度内放置半天显色

Originally posted by zhaohq1209 at 2010-11-27 12:01:24:

一般16°连接2~4小时就可以了，12个小时太长，效果反而会不好。再者就是你用什么酶做的PCR，确定3‘末尾会加入A么？

Originally posted by 大白菜123789 at 2010-11-27 09:19:39:
建议PCR完切胶回收，直接连PMD18T，一直都是这么做的，效果很好

Originally posted by zhaohq1209 at 2010-11-27 12:01:24:

一般16°连接2~4小时就可以了，12个小时太长，效果反而会不好。再者就是你用什么酶做的PCR，确定3‘末尾会加入A么？

Originally posted by yuanbo934 at 2010-11-27 15:35:13:

你做的菌落PCR是用M13吧？要检验一下引物是不是还能用，自连的在200附近又带，若没有。可能是PCR体系有问题。

Originally posted by yuanbo934 at 2010-11-27 15:35:13:

你做的菌落PCR是用M13吧？要检验一下引物是不是还能用，自连的在200附近又带，若没有。可能是PCR体系有问题。