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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by likii at 2010-11-26 17:22:00:
向各位高手请教:回收连接转化哪里出了问题?
实验过程是这样的:
目的片段只有700多bp,是普通的PCR产物经过回收试剂盒(bioer)回收得到,条带也很亮,也很单一. 连接是在PCR仪中16度连接的,十二个小时左右, ...

一般16°连接2~4小时就可以了,12个小时太长,效果反而会不好。再者就是你用什么酶做的PCR,确定3‘末尾会加入A么?
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
11楼2010-11-27 12:01:24
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likii

铜虫 (小有名气)

~~~

引用回帖:
Originally posted by yuanbo934 at 2010-11-27 09:35:08:
1 将目的片段与载体按比例混匀
2  65-70度热击2-3Min,破坏目的片段与载体的二级结构
3 加入l连接酶
4 16度连接过夜
5 将有克隆的平板在4度内放置半天显色

我一直就是按这个步骤做的,又重复了三次了,现在平板上全是蓝斑,白斑特别少,我挑了几个蓝斑和白斑一起菌液PCR了,但是结果确实是白斑,蓝斑都没有目的片段,但是pmd18-T的小条带确实是有的,还是不知道怎么回事........
加油,发文章,发好文章~
12楼2010-11-27 14:39:26
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likii

铜虫 (小有名气)

~~~

引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-11-27 12:01:24:

一般16°连接2~4小时就可以了,12个小时太长,效果反而会不好。再者就是你用什么酶做的PCR,确定3‘末尾会加入A么?

后来的重复用pmd18-T连接了五个小时,结果一样。。。
菌液PCR就是用的一般PCR的酶,pmd18-T的引物,没什么特殊的东西的,结果是蓝白斑都没有目标片段,但都有质粒的条带.........
加油,发文章,发好文章~
13楼2010-11-27 14:42:00
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likii

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 大白菜123789 at 2010-11-27 09:19:39:
建议PCR完切胶回收,直接连PMD18T,一直都是这么做的,效果很好

我们一直是这么做的,以前什么问题都没的,但是现在怎么都没有......实在是想不出哪里出问题了.......
加油,发文章,发好文章~
14楼2010-11-27 14:45:11
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)


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引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-11-27 12:01:24:

一般16°连接2~4小时就可以了,12个小时太长,效果反而会不好。再者就是你用什么酶做的PCR,确定3‘末尾会加入A么?

你做的菌落PCR是用M13吧?要检验一下引物是不是还能用,自连的在200附近又带,若没有。可能是PCR体系有问题。
15楼2010-11-27 15:35:13
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likii

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yuanbo934 at 2010-11-27 15:35:13:

你做的菌落PCR是用M13吧?要检验一下引物是不是还能用,自连的在200附近又带,若没有。可能是PCR体系有问题。

是M13,在200左右有条带的
加油,发文章,发好文章~
16楼2010-11-27 15:48:14
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513279618

银虫 (小有名气)


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我最近也遇到了这样的问题,但发现是感受态被污染了,你检查一下你的感受态能否在你的抗性培养基里生长,但在涂板时要按照转化的方式做,很可能是质粒污染了感受态。
17楼2010-11-27 17:40:44
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piaopiao233

金虫 (小有名气)


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注意你的PCR酶,是不是末端加A的,是不是可以直接做TA克隆的

要不然没办法和T载体相连的
18楼2010-11-27 18:26:55
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
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Originally posted by yuanbo934 at 2010-11-27 15:35:13:

你做的菌落PCR是用M13吧?要检验一下引物是不是还能用,自连的在200附近又带,若没有。可能是PCR体系有问题。

连接时加入500mM Nacl试试,要确定PCR 后加A.
19楼2010-11-27 18:27:38
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likii

铜虫 (小有名气)

回收出问题了~~

我们用质粒试剂盒里面的insert对照做了一次连接转化,蓝白斑筛选,结果正常,PCR检测后蓝斑是只有质粒序列,白斑有目的片段的序列。所以目前为止,可以断定连接转化的东西没有问题,问题可能是回收目的片段时可能存在影响连接的因素,从而阻碍了连接转化率,但是回收中哪一步有问题我们还没搞清楚,希望大家有什么可能性多和我说说,初学者问题多多,谢谢大家哦~~
加油,发文章,发好文章~
20楼2010-11-29 12:36:12
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