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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by likii at 2010-11-26 17:22:00:
向各位高手请教：回收连接转化哪里出了问题？
实验过程是这样的：
目的片段只有700多bp，是普通的PCR产物经过回收试剂盒（bioer）回收得到，条带也很亮，也很单一. 连接是在PCR仪中16度连接的，十二个小时左右， ...

一般16°连接2~4小时就可以了，12个小时太长，效果反而会不好。再者就是你用什么酶做的PCR，确定3‘末尾会加入A么？
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
11楼2010-11-27 12:01:24
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likii

铜虫 (小有名气)

~~~

引用回帖:
Originally posted by yuanbo934 at 2010-11-27 09:35:08:
1 将目的片段与载体按比例混匀
2  65-70度热击2-3Min，破坏目的片段与载体的二级结构
3 加入l连接酶
4 16度连接过夜
5 将有克隆的平板在4度内放置半天显色

我一直就是按这个步骤做的，又重复了三次了，现在平板上全是蓝斑，白斑特别少，我挑了几个蓝斑和白斑一起菌液PCR了，但是结果确实是白斑，蓝斑都没有目的片段，但是pmd18-T的小条带确实是有的，还是不知道怎么回事........
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12楼2010-11-27 14:39:26
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likii

铜虫 (小有名气)

~~~

引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-11-27 12:01:24:

一般16°连接2~4小时就可以了，12个小时太长，效果反而会不好。再者就是你用什么酶做的PCR，确定3‘末尾会加入A么？

后来的重复用pmd18-T连接了五个小时，结果一样。。。
菌液PCR就是用的一般PCR的酶，pmd18-T的引物，没什么特殊的东西的，结果是蓝白斑都没有目标片段，但都有质粒的条带.........
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13楼2010-11-27 14:42:00
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likii

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 大白菜123789 at 2010-11-27 09:19:39:
建议PCR完切胶回收，直接连PMD18T，一直都是这么做的，效果很好

我们一直是这么做的，以前什么问题都没的，但是现在怎么都没有......实在是想不出哪里出问题了.......
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14楼2010-11-27 14:45:11
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yuanbo934

至尊木虫 (职业作家)
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Originally posted by zhaohq1209 at 2010-11-27 12:01:24:

一般16°连接2~4小时就可以了，12个小时太长，效果反而会不好。再者就是你用什么酶做的PCR，确定3‘末尾会加入A么？

你做的菌落PCR是用M13吧？要检验一下引物是不是还能用，自连的在200附近又带，若没有。可能是PCR体系有问题。
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15楼2010-11-27 15:35:13
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likii

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yuanbo934 at 2010-11-27 15:35:13:

你做的菌落PCR是用M13吧？要检验一下引物是不是还能用，自连的在200附近又带，若没有。可能是PCR体系有问题。

是M13，在200左右有条带的
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16楼2010-11-27 15:48:14
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513279618

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我最近也遇到了这样的问题，但发现是感受态被污染了，你检查一下你的感受态能否在你的抗性培养基里生长，但在涂板时要按照转化的方式做，很可能是质粒污染了感受态。
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17楼2010-11-27 17:40:44
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piaopiao233

金虫 (小有名气)
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注意你的PCR酶，是不是末端加A的，是不是可以直接做TA克隆的

要不然没办法和T载体相连的
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18楼2010-11-27 18:26:55
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yuanbo934

至尊木虫 (职业作家)
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Originally posted by yuanbo934 at 2010-11-27 15:35:13:

你做的菌落PCR是用M13吧？要检验一下引物是不是还能用，自连的在200附近又带，若没有。可能是PCR体系有问题。

连接时加入500mM Nacl试试，要确定PCR 后加A.
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19楼2010-11-27 18:27:38
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likii

铜虫 (小有名气)

回收出问题了~~

我们用质粒试剂盒里面的insert对照做了一次连接转化，蓝白斑筛选，结果正常，PCR检测后蓝斑是只有质粒序列，白斑有目的片段的序列。所以目前为止，可以断定连接转化的东西没有问题，问题可能是回收目的片段时可能存在影响连接的因素，从而阻碍了连接转化率，但是回收中哪一步有问题我们还没搞清楚，希望大家有什么可能性多和我说说，初学者问题多多，谢谢大家哦~~
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20楼2010-11-29 12:36:12
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