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【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？ 已有10人参与
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向各位高手请教：回收连接转化哪里出了问题？ 实验过程是这样的： 目的片段只有700多bp，是普通的PCR产物经过回收试剂盒（bioer）回收得到，条带也很亮，也很单一. 连接是在PCR仪中16度连接的，十二个小时左右，然后用TAKARAde pmd18t载体连接的，而后转入感受态中，培养十二小时之后，菌长的很少，蓝白斑都有，但是白斑都是假阳性，有质粒的序列，却没有目的片段。于是我猜想或许是我加样的问题，而后又重新做了一次，依然如此，白斑都是假阳性，质粒的空载体。然后换了一个连接的试剂盒，PGEM载体连接，这次菌长的都少了，而且蓝斑很多，两个板子一个没有长，一个上面只挑得出五个单克隆。经过检测都是假阳性，没有目的片段。不知道是哪里出了问题，感受态是最近几天配的，有菌落长出来，应该不是感受态的问题吧？蓝白斑筛选也没有错，会不会x-gal和IPTG失效，可是有蓝斑也有白斑，应该不是他们吧，其他的我就不知道了，pmd18-T质粒是新买的，按理说也不会的吧，培养基都是新配的。在我之后我师兄做了几次连接也是相同的情况，只有空的质粒，没有目的片段，而且平板上都是蓝斑，白斑很少，不知道哪里有问题，请各位精通的大师帮忙分析一下~~万分感谢！！！ |
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3楼2010-11-26 18:16:58
天使托
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T.Shen
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2楼2010-11-26 17:53:51
4楼2010-11-26 18:19:54
5楼2010-11-26 19:48:37