应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
211/3返回列表123下一页
查看: 4125  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

likii

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？ 已有10人参与

向各位高手请教：回收连接转化哪里出了问题？
实验过程是这样的：
目的片段只有700多bp，是普通的PCR产物经过回收试剂盒（bioer）回收得到，条带也很亮，也很单一. 连接是在PCR仪中16度连接的，十二个小时左右，然后用TAKARAde pmd18t载体连接的，而后转入感受态中，培养十二小时之后，菌长的很少，蓝白斑都有，但是白斑都是假阳性，有质粒的序列，却没有目的片段。于是我猜想或许是我加样的问题，而后又重新做了一次，依然如此，白斑都是假阳性，质粒的空载体。然后换了一个连接的试剂盒，PGEM载体连接，这次菌长的都少了，而且蓝斑很多，两个板子一个没有长，一个上面只挑得出五个单克隆。经过检测都是假阳性，没有目的片段。不知道是哪里出了问题，感受态是最近几天配的，有菌落长出来，应该不是感受态的问题吧？蓝白斑筛选也没有错，会不会x-gal和IPTG失效，可是有蓝斑也有白斑，应该不是他们吧，其他的我就不知道了，pmd18-T质粒是新买的，按理说也不会的吧，培养基都是新配的。在我之后我师兄做了几次连接也是相同的情况，只有空的质粒，没有目的片段，而且平板上都是蓝斑，白斑很少，不知道哪里有问题，请各位精通的大师帮忙分析一下~~万分感谢！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
加油，发文章，发好文章~
1楼 2010-11-26 17:22:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yinsongna

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-11-27 08:44:50
确定回收没问题的话，考虑一下连接问题，是不是连接体系有问题，目的片段：载体=（3~10）：1
赞一下(3人) 回复此楼
5楼2010-11-26 19:48:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-26 18:38:17
为什么要用连接试剂盒呢？
直接酶切，然后ligase一样就可以了；一般蓝白斑筛选就可以筛选出来的，至于为什么没有目的基因序列，不知道你是怎么验证的？pcr还是提质粒酶切验证的?

我的建议：重新连接，然后转化...........
赞一下(2人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2010-11-26 17:53:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

likii

铜虫 (小有名气)

菌液PCR检测的

★ ★ ★
dhd997(金币+3):鼓励新虫交流 2010-11-27 08:44:28
检测就是菌液PCR然后电泳检测的，经过我的描述你应该知道我们已经重复了五次了~~就是把目的片段连接到质粒里面啊，我好像没有说连接试剂盒的哦~~谢谢你哦~~
赞一下(1人) 回复此楼
加油，发文章，发好文章~
3楼2010-11-26 18:16:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

likii

铜虫 (小有名气)

兼并引物做出来的片段

呵呵，我不太懂那个算是连接试剂盒，我们是兼并引物做出来的片段，所以没法设计特异性接头进行酶切。。。。衰啊。。。
赞一下 回复此楼
加油，发文章，发好文章~
4楼2010-11-26 18:19:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

likii

铜虫 (小有名气)

怎么确定怎么回收没有问题~~

dhd997:建议引用回复，方便虫友看到，及时回答问题。 2010-11-27 08:45:23
怎么确定怎么回收没有问题啊？我回收出的条带很单一也很亮，不知道怎么确定它有没问题~~
赞一下(1人) 回复此楼
加油，发文章，发好文章~
6楼2010-11-26 20:16:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yinsongna

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by likii at 2010-11-26 20:16:33:
怎么确定怎么回收没有问题啊？我回收出的条带很单一也很亮，不知道怎么确定它有没问题~~

你回收之后跑个电泳看下就好了
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2010-11-27 09:10:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大白菜123789

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议PCR完切胶回收，直接连PMD18T，一直都是这么做的，效果很好
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2010-11-27 09:19:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1 将目的片段与载体按比例混匀
2  65-70度热击2-3Min，破坏目的片段与载体的二级结构
3 加入l连接酶
4 16度连接过夜
5 将有克隆的平板在4度内放置半天显色
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2010-11-27 09:35:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

森林女巫

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by likii at 2010-11-26 17:22:00:
向各位高手请教：回收连接转化哪里出了问题？
实验过程是这样的：
目的片段只有700多bp，是普通的PCR产物经过回收试剂盒（bioer）回收得到，条带也很亮，也很单一. 连接是在PCR仪中16度连接的，十二个小时左右， ...

空载体就是说质粒没有转进去，如果目的片段回收和纯化以及连接都没有问题的话，可以试试转化方式，还有在涂菌的时候注意灭菌消毒。祝你成功哦
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2010-11-27 10:36:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 likii 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +7 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 9/450 2026-08-31 01:15 by hZiFeudZyoGR
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +6 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 9/450 2026-08-31 01:05 by hZiFeudZyoGR
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +6 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 8/400 2026-08-31 00:54 by hZiFeudZyoGR
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 4FFAWE8HcgUD 2026-08-29 4/200 2026-08-30 20:40 by hZiFeudZyoGR
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 4FFAWE8HcgUD 2026-08-29 5/250 2026-08-30 20:29 by hZiFeudZyoGR
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 5/250 2026-08-30 19:48 by hZiFeudZyoGR
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 5/250 2026-08-30 18:40 by hZiFeudZyoGR
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 17:47 by hZiFeudZyoGR
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 10/500 2026-08-30 17:36 by hZiFeudZyoGR
[基金申请] 面上意见出来了 +9 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 18/900 2026-08-30 16:47 by 黄鸟于飞Chao
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 5/250 2026-08-30 14:03 by GkCVyODlx4mR
[基金申请] 29号明天会评吗 +3 笨笨唐 2026-08-28 3/150 2026-08-30 09:29 by cww8181
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-30 05:48 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭