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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？
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蜗牛061610

木虫 (小有名气)

1

[求助] 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？

有人说如果质粒上两个切点紧挨着的话，双酶切容易切错。我就先用一个酶进行酶切，切完后过pcr纯化试剂盒后用第二个酶进行酶切，再过pcr纯化试剂盒进行酶连。酶连了两批，挑去转化子抽取质粒进行pcr鉴定都是假阳性，搞不清楚是什么原因。

[ 来自科研家族 化学生物学 ]
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1
1楼2011-10-09 14:13:32
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amilie030312

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助发帖！ 2011-10-09 20:19:42
蜗牛061610(金币+2): 谢谢交流 2011-10-10 08:29:41
两个酶切位点挨的近那是有多近啊？质粒要计算保护碱基的话要计算保护碱基对不是保护碱基个数，如果保护碱基不够酶切就没办法切好，我有疑问的是你为啥每次酶切完了都要回收一下，质粒损失多大啊。另外，连接如果连接不上看是否是酶切的末端有平也有粘，这样不太好连的，最好两边都是4碱基突出的粘端是最好连的。至于假阳性，出现这个结果的可能性还真不是一句两句说得清的，一个问题一个问题排除吧。
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2楼2011-10-09 14:30:25
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2011-10-09 20:19:50
这个很有可能是载体没有切好所致，你最好翻一下酶的说明书，两个挨在一起的位点酶切时是有顺序要求的，不对的话很容易不完全，产生的多是载体自连的克隆，如果有选择的话建议换个载体或者换换酶切位点的好
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在等待中涅槃重生
3楼2011-10-09 16:41:11
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hf2016

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

酷似您这是不好酶切的原因比达大
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一切开始于结束之后
4楼2011-10-09 21:18:43
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-10-09 23:00:36
两个酶切位点太近的话会出现保护碱基不够的情况，所以很有可能是质粒没有切好，出现这个情况解决的办法不多呀，你最好还是换个离的稍远一点的酶切位点试试吧
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5楼2011-10-09 22:12:43
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蜗牛061610

木虫 (小有名气)

1
引用回帖:
2楼: Originally posted by amilie030312 at 2011-10-09 14:30:25:
两个酶切位点挨的近那是有多近啊？质粒要计算保护碱基的话要计算保护碱基对不是保护碱基个数，如果保护碱基不够酶切就没办法切好，我有疑问的是你为啥每次酶切完了都要回收一下，质粒损失多大啊。另外，连接如果连 ...

我看了下序列，两个切点是紧挨着的，中间没有保护碱基。因为两个酶用的buffer不一样，一个酶切完以后得回收质粒再切。不回收就不能用第二个酶进行酶切。切点分别是xho1和kpn1，都是粘性末端。
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1
6楼2011-10-10 08:19:46
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蜗牛061610

木虫 (小有名气)

1
引用回帖:
5楼: Originally posted by ganchao1776 at 2011-10-09 22:12:43:
两个酶切位点太近的话会出现保护碱基不够的情况，所以很有可能是质粒没有切好，出现这个情况解决的办法不多呀，你最好还是换个离的稍远一点的酶切位点试试吧

貌似只能换换了，当初连接是想连接T载，后来连接T载效率很低（我是将左右中三个片段和T载连，左右两个片段和T载就竞争性结合，使得连接的效率很低），就想着连接质粒，当时就傻了：这两个切点我们实验室只有一个质粒能用，而且两个切点还都紧挨着
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1
7楼2011-10-10 08:26:55
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amilie030312

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 蜗牛061610 at 2011-10-10 08:19:46:
我看了下序列，两个切点是紧挨着的，中间没有保护碱基。因为两个酶用的buffer不一样，一个酶切完以后得回收质粒再切。不回收就不能用第二个酶进行酶切。切点分别是xho1和kpn1，都是粘性末端。

XhoI和KpnI是可以同一种Buffer的啊，你看
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8楼2011-10-12 13:01:10
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lw19850128

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2313510楼: Originally posted by yuxia82012 at 2011-10-09 16:41:11
这个很有可能是载体没有切好所致，你最好翻一下酶的说明书，两个挨在一起的位点酶切时是有顺序要求的，不对的话很容易不完全，产生的多是载体自连的克隆，如果有选择的话建议换个载体或者换换酶切位点的好

我之前也是遇到这个问题，不过换了下两个酶的先后顺序解决了。楼主条克隆呈假阳性建议多作对照，把酶切产物做个转化对照看看，感受态也做个阴性对照看看~
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9楼2012-07-10 12:51:59
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erlangshen89

木虫 (小有名气)
不同顺序酶切的话还用先回收再用另一个酶切还是直接再加入另一个酶？
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10楼2013-08-09 10:56:29
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