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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？
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蜗牛061610

木虫 (小有名气)

1

[求助] 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？

有人说如果质粒上两个切点紧挨着的话，双酶切容易切错。我就先用一个酶进行酶切，切完后过pcr纯化试剂盒后用第二个酶进行酶切，再过pcr纯化试剂盒进行酶连。酶连了两批，挑去转化子抽取质粒进行pcr鉴定都是假阳性，搞不清楚是什么原因。

[ 来自科研家族 化学生物学 ]
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1
1楼 2011-10-09 14:13:32
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amilie030312

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 蜗牛061610 at 2011-10-10 08:19:46:
我看了下序列，两个切点是紧挨着的，中间没有保护碱基。因为两个酶用的buffer不一样，一个酶切完以后得回收质粒再切。不回收就不能用第二个酶进行酶切。切点分别是xho1和kpn1，都是粘性末端。

XhoI和KpnI是可以同一种Buffer的啊，你看
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8楼2011-10-12 13:01:10
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amilie030312

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助发帖！ 2011-10-09 20:19:42
蜗牛061610(金币+2): 谢谢交流 2011-10-10 08:29:41
两个酶切位点挨的近那是有多近啊？质粒要计算保护碱基的话要计算保护碱基对不是保护碱基个数，如果保护碱基不够酶切就没办法切好，我有疑问的是你为啥每次酶切完了都要回收一下，质粒损失多大啊。另外，连接如果连接不上看是否是酶切的末端有平也有粘，这样不太好连的，最好两边都是4碱基突出的粘端是最好连的。至于假阳性，出现这个结果的可能性还真不是一句两句说得清的，一个问题一个问题排除吧。
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2楼2011-10-09 14:30:25
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2011-10-09 20:19:50
这个很有可能是载体没有切好所致，你最好翻一下酶的说明书，两个挨在一起的位点酶切时是有顺序要求的，不对的话很容易不完全，产生的多是载体自连的克隆，如果有选择的话建议换个载体或者换换酶切位点的好
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在等待中涅槃重生
3楼2011-10-09 16:41:11
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hf2016

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

酷似您这是不好酶切的原因比达大
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一切开始于结束之后
4楼2011-10-09 21:18:43
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