[交流] ppic9k质粒双酶切

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1楼 2011-06-25 16:59:46

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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

★ ★ ★
qwky2010(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 欢迎交流。顺便请教下，具体怎么说呢？ 2011-06-25 18:24:46

看你用的是什么酶了。

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qwky2010

2楼2011-06-25 17:19:16

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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

★
qwky2010(金币+1):谢谢参与

以前有人讨论过这个问题，酶切后的质粒有时候是会比没有切的跑得更快。跟Marker比较下，大小对了就没问题了。

3楼2011-06-25 18:20:42

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qwky2010

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Originally posted by lxj341401 at 2011-06-25 17:19:16:
看你用的是什么酶了。

谢谢你昨天和今天的回复，我用的是not1和ecoR1这两个酶，体系是你昨天发给我的，不知道该怎么办，多多指点谢谢~

4楼2011-06-25 20:49:23

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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-06-25 21:36:53

引用回帖:

Originally posted by qwky2010 at 2011-06-25 20:49:23:
谢谢你昨天和今天的回复，我用的是not1和ecoR1这两个酶，体系是你昨天发给我的，不知道该怎么办，多多指点谢谢~

那就不应该出这样的结果了，两个酶切位点很近的，切下来大片段应该有9K多呢。你酶切时间和酶量加了多少？酶切时间长了和酶加多了会出现星号活力的。另外要加跑个marker，看看切出来的分子大小。

5楼2011-06-25 21:07:54

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qwky2010

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引用回帖:

Originally posted by lxj341401 at 2011-06-25 21:07:54:
那就不应该出这样的结果了，两个酶切位点很近的，切下来大片段应该有9K多呢。你酶切时间和酶量加了多少？酶切时间长了和酶加多了会出现星号活力的。另外要加跑个marker，看看切出来的分子大小。

我的酶量均加入3ul，质粒加入36ul,buf加了5ul,共50ul体系，37度12h，如果说是加酶量过多，我要重新再提取质粒，然后再减少酶量进行双酶切吗

[ Last edited by qwky2010 on 2011-6-25 at 22:05 ]

6楼2011-06-25 21:50:59

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gwbk

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★
qwky2010(金币+1):谢谢参与

酶切时间太长，可能有非特异性切割。可以切3个小时试试。
另外，NotI和EcoRI的buffer是1×H+BSA，BSA终浓度100ug/ml。

7楼2011-06-26 00:29:55

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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

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dhd997(金币+5, EPI+1): 一并奖励 2011-06-27 16:20:38

引用回帖:

Originally posted by qwky2010 at 2011-06-25 21:50:59:
我的酶量均加入3ul，质粒加入36ul,buf加了5ul,共50ul体系，37度12h，如果说是加酶量过多，我要重新再提取质粒，然后再减少酶量进行双酶切吗

[ Last edited by qwky2010 on 2011-6-25 at 22:05 ]

太多了，酶的量不能超过体积的10%，多了里面的甘油就多了，出现星号活力，而且你酶切时间也太长了。

8楼2011-06-26 07:52:01

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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:

Originally posted by gwbk at 2011-06-26 00:29:55:
酶切时间太长，可能有非特异性切割。可以切3个小时试试。
另外，NotI和EcoRI的buffer是1×H+BSA，BSA终浓度100ug/ml。

你说的是TAKALA公司的缓冲液，他用的是Fermentas公司的酶，推荐给他的缓冲液没错，是在该公司网站帮他查的。

9楼2011-06-26 10:37:55

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gwbk

木虫 (正式写手)

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恩，我也是刚想到的。我错了。