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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切质粒后，目的条带浅且前方有模糊亮带
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Angela-Fish

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】双酶切质粒后，目的条带浅且前方有模糊亮带 已有10人参与

今天做了个双酶切，用EcoR 1和HindIII对质粒进行双酶切，本来在紫外灯下应该是两条清晰的亮带，且短的是我的目的条带，但是电泳之后却是如下的：

宽条带底部的那条不是很清晰的条带是我的目的条带，请问泳道最前方的模糊的条带是什么东西呢，谢谢！
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1楼 2010-05-12 21:54:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yan2009

木虫 (小有名气)

金虫（著名写手）
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
酶的专一性不强，重新订支新酶，质粒的纯度也不高，才会这样，重新转化质粒，大提后，测质粒浓度，至少达到750ng/ul，再做双酶切，可以成功，祝你好运！
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9楼2010-05-13 08:38:47
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普通回帖

pidou213

木虫 (正式写手)
是不是没有切完的基因呢？？或者说没有切下来
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见得多爱的多
2楼2010-05-12 23:21:05
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-05-13 06:43:03
切的是质粒吗？
如果切的是质粒，质粒是如何提取的？RNAse何时加的？
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
3楼2010-05-12 23:29:24
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tmvb

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-05-13 06:42:44
是不是你的酶切专属性不强啊，切出了多个片段
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4楼2010-05-12 23:35:39
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Angela-Fish

新虫 (初入文坛)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-05-13 06:42:32
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-05-12 23:21:05:
是不是没有切完的基因呢？？或者说没有切下来

应该不是，如果基因没切完全，或者只是单酶切，那应该是线状的，相对分子质量应该还是挺大的，条带也是在后面的，不可能跑到最前面啊
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5楼2010-05-13 00:04:59
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Angela-Fish

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 香菱儿 at 2010-05-12 23:29:24:
切的是质粒吗？
如果切的是质粒，质粒是如何提取的？RNAse何时加的？

是质粒啊，是师哥提供的质粒，该质粒已经确定是连接了目的片段的载体质粒，我现在就是要把这个目的片段切下来。RNAase我不太清楚加了没有，不过我觉得应该不是这个问题吧。和这个一批做的另外一个连接有相似片段的同样的载体质粒，同样双酶切后就出现了清晰的两条带。我不知道是不是质粒存放过程中受到了核酶的污染啊。这些质粒都是在EP管里存放于-20度里的。
神啊，这是为什么呢~~
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6楼2010-05-13 00:12:01
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zhaosoo

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
质粒重新转化后，再提质粒酶切
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7楼2010-05-13 01:29:45
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★ ★ ★ ★ ★
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reasonspare(金币+4):谢谢分享。 2010-05-13 06:43:16
1.点样孔有蛋白残留，是手工碱裂法替的质粒吗？如果是质粒没提干净，最好再用苯酚异戊醇再抽屉一下。苯酚异戊醇处理完后再做乙醇沉淀。
2.也可能酶量加多了，甘油含量太高，酶产生star活性，切城了smear。酶的作用环境不好，质粒质量不高都容易切城smear，尤其是双酶切
3.酶污染了
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终于熬成木虫了……
8楼2010-05-13 02:58:52
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★
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引用回帖:
Originally posted by yan2009 at 2010-05-13 08:38:47:
酶的专一性不强，重新订支新酶，质粒的纯度也不高，才会这样，重新转化质粒，大提后，测质粒浓度，至少达到750ng/ul，再做双酶切，可以成功，祝你好运！

有个小疑惑，对于质粒浓度
一般的克隆不需要这么高的要求吧？
特别是表达载体如pET28，复制量没有克隆载体高。一般试剂盒小提2ml用30ul水洗脱质粒浓度在100ng/ul左右，双酶切8ul做胶回收就很够用了
是做什么实验质粒浓度至少要达到750ng/ul?
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终于熬成木虫了……
10楼2010-05-14 05:00:10
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