24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 3086  |  回复: 12

Angela-Fish

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】双酶切质粒后,目的条带浅且前方有模糊亮带已有10人参与

今天做了个双酶切,用EcoR 1和HindIII对质粒进行双酶切,本来在紫外灯下应该是两条清晰的亮带,且短的是我的目的条带,但是电泳之后却是如下的:

宽条带底部的那条不是很清晰的条带是我的目的条带,请问泳道最前方的模糊的条带是什么东西呢,谢谢!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yan2009

木虫 (小有名气)

金虫(著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
酶的专一性不强,重新订支新酶,质粒的纯度也不高,才会这样,重新转化质粒,大提后,测质粒浓度,至少达到750ng/ul,再做双酶切,可以成功,祝你好运!
9楼2010-05-13 08:38:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

pidou213

木虫 (正式写手)

是不是没有切完的基因呢??或者说没有切下来
见得多爱的多
2楼2010-05-12 23:21:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-05-13 06:43:03
切的是质粒吗?
如果切的是质粒,质粒是如何提取的?RNAse何时加的?
漫洒英雄泪,相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行?一任俺芒鞋破钵随缘化!
3楼2010-05-12 23:29:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tmvb

新虫 (初入文坛)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-05-13 06:42:44
是不是你的酶切专属性不强啊,切出了多个片段
4楼2010-05-12 23:35:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Angela-Fish

新虫 (初入文坛)

★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-05-13 06:42:32
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-05-12 23:21:05:
是不是没有切完的基因呢??或者说没有切下来

应该不是,如果基因没切完全,或者只是单酶切,那应该是线状的,相对分子质量应该还是挺大的,条带也是在后面的,不可能跑到最前面啊
5楼2010-05-13 00:04:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Angela-Fish

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 香菱儿 at 2010-05-12 23:29:24:
切的是质粒吗?
如果切的是质粒,质粒是如何提取的?RNAse何时加的?

是质粒啊,是师哥提供的质粒,该质粒已经确定是连接了目的片段的载体质粒,我现在就是要把这个目的片段切下来。RNAase我不太清楚加了没有,不过我觉得应该不是这个问题吧。和这个一批做的另外一个连接有相似片段的同样的载体质粒,同样双酶切后就出现了清晰的两条带。我不知道是不是质粒存放过程中受到了核酶的污染啊。这些质粒都是在EP管里存放于-20度里的。
神啊,这是为什么呢~~
6楼2010-05-13 00:12:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaosoo

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
质粒重新转化后,再提质粒酶切
7楼2010-05-13 01:29:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上

★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
reasonspare(金币+4):谢谢分享。 2010-05-13 06:43:16
1.点样孔有蛋白残留,是手工碱裂法替的质粒吗?如果是质粒没提干净,最好再用苯酚异戊醇再抽屉一下。苯酚异戊醇处理完后再做乙醇沉淀。
2.也可能酶量加多了,甘油含量太高,酶产生star活性,切城了smear。酶的作用环境不好,质粒质量不高都容易切城smear,尤其是双酶切
3.酶污染了
终于熬成木虫了……
8楼2010-05-13 02:58:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by yan2009 at 2010-05-13 08:38:47:
酶的专一性不强,重新订支新酶,质粒的纯度也不高,才会这样,重新转化质粒,大提后,测质粒浓度,至少达到750ng/ul,再做双酶切,可以成功,祝你好运!

有个小疑惑,对于质粒浓度
一般的克隆不需要这么高的要求吧?
特别是表达载体如pET28,复制量没有克隆载体高。一般试剂盒小提2ml用30ul水洗脱质粒浓度在100ng/ul左右,双酶切8ul做胶回收就很够用了
是做什么实验质粒浓度至少要达到750ng/ul?
终于熬成木虫了……
10楼2010-05-14 05:00:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Angela-Fish 的主题更新
普通表情 高级回复(可上传附件)
信息提示
请填处理意见