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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒单酶切出现两条带
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bla2009

铜虫 (小有名气)

[求助] 质粒单酶切出现两条带

我的质粒是pGBKT7, 上面有EcoRI, BamHI,两个酶切位点，我分别单酶切，却跑出了两条带；另外这两个酶切位点是挨着的，中间只隔了几个碱基，可是我用这两个酶进行双酶切，却也跑出了两条带，这是怎么回事啊，高手请赐教。
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等笨笨
1楼 2011-04-29 16:04:03
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liby

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-04-29 23:42:11
bla2009(金币+1): 2011-05-05 08:35:21
是不是根本没有切开，
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2楼2011-04-29 17:12:31
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bla2009

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liby at 2011-04-29 17:12:31:
是不是根本没有切开，

应该不会啊，因为有时候条带正常，有时候又不正常
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等笨笨
3楼2011-04-29 18:02:18
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zlu520

至尊木虫 (职业作家)

限制人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-04-29 23:41:55
bla2009(金币+1): 2011-05-05 08:35:43
同时用两种酶酶切时应该控制好两种酶的最适合pH，否则酶切会不完全的。或则分别酶切。
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无完人！
4楼2011-04-29 19:03:36
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郝钊

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 很有可能~ 2011-04-29 23:39:56
bla2009(金币+1): 2011-05-01 18:36:55
是不是除了你知道的这个酶切位点，在其他位置还有同样的酶切位点啊？或者酶切不彻底，没有完全切开，一条带是线性的，另一条是超螺旋的。
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5楼2011-04-29 19:29:30
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-04-29 23:42:28
bla2009(金币+1): 2011-05-04 23:20:21
1：看看你的这个载体上面到底有几个EcoRI 和BamHI酶切位点；
2：按照你说的，两个酶，各单酶切居然有两条带，说明载体上这两个酶切位点各有两个；
3：你后面又说双酶切也是两条带，我感觉又有些矛盾了

所以你先看看质粒的图谱。。。
能不能将你的电泳图传上来看看呢？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-04-29 22:13:57
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-04-30 09:12:32
前几楼说得有道理，酶切不完全话，就会出现单链、超螺旋，甚至开环的带。
不知你的质粒是否连了外源片段，连了的话也要检查下它的酶切位点。
双酶切一定要注意，不能选用离得太近的两个酶切位点，因为酶需要一定的空间，离得太近了切不好。一般要隔10多个bp以上。
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7楼2011-04-29 23:46:53
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): 非常专业，非常辛苦，非常热心！ 2011-04-30 09:13:17
你贴出电泳图把，不然啥也说明不了
给你做了个质粒图谱，以后你最好把你的图谱也弄出来

从上边可以看出，这两个酶都是只有一个单一的酶切位点
酶切不完全的可能性很大
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8楼2011-04-30 04:36:43
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

不过说实话，EcoRI, BamHI,这两个酶这么强大，说他们不完全酶切，我都不大相信
呵呵，贴图之后再说
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9楼2011-04-30 04:44:48
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bla2009

铜虫 (小有名气)
谢谢7楼帮我做的质粒图以及大家热心的解答。下面的就是我做的图，
第一张左边是用EcoRI单酶切的，条带正常，右边是用EcoRI和BamHI双酶切的，两个酶之间只隔了10bp 却出现了两条带。
第二张左边是用EcoRI单酶切，右边是用BamHI双酶切的，其中3应该是还没有切开，但是5我就很纳闷。
第三张也是用用EcoRI和BamHI双酶切的，也出现了两条带。
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等笨笨
10楼2011-04-30 10:55:16
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