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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点 已有25人参与

我现在在做一个基因的昆虫表达，表达载体是用的是pFast HT A（载体有4850bp）。我的基因目前上到了PMD18-T的载体上，带酶切位点，已经测序验证了，基因和酶切位点及保护碱基都是完整正确的，内切酶用得是Hind III 和Spe I
酶切回收的片段和载体质量都还不错，条带明亮单一，浓度约为50ng/ul
反复做了好多次，T4连接酶过夜连接 做转化，都是不长斑。
隐形对照加的酶切后的空载体，阳性对照用得是未酶切的载体，结果也没问题。
T4连接酶买的新的，感受态也是新的。
那么我的问题到底出在哪里呢？
求高手指点。非常感谢，现在做的都快吐了……
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
1楼 2011-06-22 10:03:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sunningheart

铁虫 (初入文坛)
★
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我做的也一直不长斑，找不出原因。
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33楼2012-08-30 10:24:56
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peace12039088

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-28 18:39:43
这样的问题建议做电转化，效率会高些。此外目标片段与目标载体的比例不一定非要按照理论比例，可以依据回收后的电泳检测结果来加入，这样可能有点不科学，但我每次都是这样做出来的。还有就是电泳显示的同样亮度的大小不同片段，片段大的浓度低，片段小的浓度高。
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21楼2011-06-27 11:09:42
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到了类似的情况，转空载体时能长菌，但转连接产物时，平板上什么也不长，目前不知道原因，十分烦呀！
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自己的人生是要靠自己改变的！
34楼2012-08-31 22:04:40
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普通回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking: 2011-06-22 18:50:37
怎么看的那么糊涂？还是我智商有问题？
楼主是不是想把PMD载体上的一段双酶切下来然后连接至pFast HT A上进行表达呢？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-06-22 10:06:56
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-22 10:06:56:
怎么看的那么糊涂？还是我智商有问题？
楼主是不是想把PMD载体上的一段双酶切下来然后连接至pFast HT A上进行表达呢？

是的呢
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
3楼2011-06-22 10:13:03
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garry86

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-06-22 16:51:41
本帖内容被屏蔽
4楼2011-06-22 10:21:34
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-06-22 18:50:46
1949stone(金币+1): 继续鼓励 2011-06-27 12:36:30
引用回帖:
Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2011-06-22 10:03:09:
我现在在做一个基因的昆虫表达，表达载体是用的是pFast HT A（载体有4850bp）。我的基因目前上到了PMD18-T的载体上，带酶切位点，已经测序验证了，基因和酶切位点及保护碱基都是完整正确的，内切酶用得是Hind III ...

1:你现在有没有将那一段双酶切下来？
2：还是酶切下来了，但是一直连接不上？酶切位点对不对？
3：你连接转化最后涂布是用什么筛选的？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-06-22 10:24:32
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-22 10:24:32:
1:你现在有没有将那一段双酶切下来？
2：还是酶切下来了，但是一直连接不上？酶切位点对不对？
3：你连接转化最后涂布是用什么筛选的？

已经切下来了，一直连接不上，酶切位点没错，片段大小事吻合的
抗性是amp的
空载体转化的感受态可以长，连接产物转化的长不出来~
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6楼2011-06-22 10:26:59
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by garry86 at 2011-06-22 10:21:34:
pFast HT A表达载体没使用过~  至少保证载体上有Hind III 和Spe I两个位点吧，酶切之后要确保载体和片段都被切开了，切胶回收的是正确的片段，然后检查连接体系正确与否~   连接片段最少需要0.3pmol  载体需要0.0 ...

祝好运啊，我一直没做出来，烦呢
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7楼2011-06-22 10:27:41
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蚊在江湖

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 欢迎交流 2011-06-22 16:52:08
考虑点其他原因

我曾经做了几个月没有做出来，结果是抗生素出了问题

试剂公司贴的是青霉素的标签，结果不是。

建议都借别人已成功的实验材料或者做成功了的同学帮你做，试试看。
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8楼2011-06-22 10:56:05
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 热心专家 2011-06-22 16:52:21
引用回帖:
Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2011-06-22 10:26:59:
已经切下来了，一直连接不上，酶切位点没错，片段大小事吻合的
抗性是amp的
空载体转化的感受态可以长，连接产物转化的长不出来~

个人认为是你连接体系的问题，不知道你的体系是怎么样的？
可以将DNA浓度提高一些，是在载体的2-3倍。也可以连接时间长一些。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
9楼2011-06-22 11:03:29
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 蚊在江湖 at 2011-06-22 10:56:05:
考虑点其他原因

我曾经做了几个月没有做出来，结果是抗生素出了问题

试剂公司贴的是青霉素的标签，结果不是。

建议都借别人已成功的实验材料或者做成功了的同学帮你做，试试看。

恩，可以试试
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
10楼2011-06-22 11:06:11
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